羅瑋，周雅，鞏尊洋，杜瑤，顧秋亞，余曉斌

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

番茄紅素是是一種脂溶性的不飽和碳?xì)浠衔?，性質(zhì)非?；顫?，具有極強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域［1-2］。在自然界中含有番茄紅素量比較高的有番茄、番石榴、西瓜、紅色的葡萄柚等紅色水果，尤其番茄中的番茄紅素占其類胡蘿卜素總量的80%左右。除此以外，許多絲狀真菌如布拉克須霉［3］、卷枝毛霉［4］和三孢布拉霉［5］中也含有大量的番茄紅素，其含量遠(yuǎn)超過植物中番茄紅素含量水平。且微生物的生長和代謝不受氣候和土地等資源制約，可以大規(guī)模培養(yǎng)。目前已經(jīng)在三孢布拉霉中實(shí)現(xiàn)了β-胡蘿卜素的工業(yè)化生產(chǎn)，因此通過絲狀真菌的規(guī)?；囵B(yǎng)有望實(shí)現(xiàn)番茄紅素的大規(guī)模生產(chǎn)。

三孢布拉霉是一種絲狀真菌，屬于霜霉目、藻狀菌綱、白銹科，拉丁名是 Blakeslea trispora，是一種雌雄異體的接合菌。三孢布拉霉對(duì)營養(yǎng)要求簡單、生長速度快且類胡蘿卜素含量高，使其成為生產(chǎn)番茄紅素的理想菌株［6-7］。三孢布拉霉有正負(fù)菌之分，負(fù)菌是番茄紅素的主要生產(chǎn)者。番茄紅素是三孢布拉霉合成β-胡蘿卜素的一種中間代謝產(chǎn)物，要實(shí)現(xiàn)番茄紅素在胞內(nèi)累積，必須添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑阻斷番茄紅素被進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成β-胡蘿卜素。

本研究以本實(shí)驗(yàn)室選育獲得的一株番茄紅素高產(chǎn)突變株為對(duì)象，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和其他關(guān)鍵參數(shù)，以期進(jìn)一步提高其番茄紅素產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

儀器:恒溫培養(yǎng)箱、可見光分光光度計(jì)、恒溫?fù)u床、pH儀、離心機(jī)、抽濾機(jī)、高壓蒸汽滅菌鍋、旋轉(zhuǎn)真空干燥器等。

試劑:番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司，磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、棉籽油、二甲基咪唑、石油醚、二氯甲烷均為分析純。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

三孢布拉霉菌(B.trispora)高產(chǎn)突變株ZY通過常壓室溫等離子誘變系統(tǒng)選育獲得，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

各種培養(yǎng)基如下:

固體培養(yǎng)基:麥汁4°，瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基:玉米粉25 g/L，黃豆粉50 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.3，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉50 g/L，黃豆粉25 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 6.3，棉籽油30 g/L，121℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng):在無菌條件下，將三孢布拉霉正負(fù)孢子(正菌104個(gè)孢子/mL，負(fù)菌105個(gè)孢子/mL)分別接入種子培養(yǎng)基，在25℃，180 r/min的條件下，培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng):將生長旺盛的正負(fù)菌種子液按1∶5的比例在無菌的條件下混合，再以20%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在25℃，180 rpm的條件下，培養(yǎng)120 h，在培養(yǎng)48 h時(shí)添加0.1 g/L 2-甲基咪唑。

1.4 分析方法

發(fā)酵120 h之后，收集菌絲體用蒸餾水洗滌后紗布過濾，40℃真空干燥過夜。干燥后在天平上準(zhǔn)確稱量。取適量干菌絲體加石英砂研磨破碎菌絲體，用石油醚抽提至菌體無色，合并抽提液，適當(dāng)稀釋后于502 nm下測定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算番茄紅素含量。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

本研究設(shè)計(jì)了4因素3水平的正交試驗(yàn)，其因素及水平安排如表1所示。

表1 各個(gè)因素梯度設(shè)計(jì)Table 1 The design of factors and level

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基中碳源的影響

碳源對(duì)微生物生長代謝以及產(chǎn)物合成至關(guān)重要，不同微生物對(duì)碳源的利用度和代謝能力也不盡相同。本實(shí)驗(yàn)選擇了幾種常見的單糖、二糖、寡糖以及多糖(葡萄糖、蔗糖、低聚麥芽糖、玉米粉、可溶性淀粉)作為代表，分別添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，保持培養(yǎng)基其他成份相同，對(duì)三孢布拉霉分別利用這5種碳源合成番茄紅素的能力進(jìn)行了比較。由該圖2所示，多糖比單糖在促進(jìn)菌體生長和番茄紅素含量上效果要好。絲狀真菌大多合成含量豐富的淀粉酶類，能夠高效利用淀粉類碳源。同時(shí)，從圖1中可以看出添加玉米粉的發(fā)酵效果要優(yōu)于可溶性淀粉。這是因?yàn)槿卟祭故且环N高度嗜黏微生物，因此培養(yǎng)基中添加玉米粉等固形物有利于菌絲體附著和生長以及番茄紅素累積。Papaioannou等［8］也對(duì)三孢布拉霉的底物進(jìn)行了研究，他們選擇葡萄糖、乳糖和淀粉作為代表，發(fā)現(xiàn)三孢布拉霉能更有效利用淀粉和乳糖合成類胡蘿卜素，尤其是采用淀粉作為碳源能夠有效增加細(xì)胞干重和番茄紅素生產(chǎn)強(qiáng)度，其作用機(jī)理可能在于淀粉是一種緩釋性碳源，其在三孢布拉霉胞內(nèi)多種淀粉酶作用下緩慢釋放出單糖避免了分解代謝組阻遏效應(yīng)。

圖1 不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on lycopene fermentation

2.2 培養(yǎng)基中氮源影響

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考查了幾種氮源(玉米漿、黃豆粉、酵母膏、NaNO3和(NH4)2SO4對(duì)三孢布拉霉合成番茄紅素含量及生物量的影響。從圖2可以看出，有機(jī)氮源對(duì)菌體生長和番茄紅素合成效果要優(yōu)于無機(jī)氮源，其中黃豆粉效果最好，其生物量及番茄紅素的產(chǎn)量均比其他4種氮源更高。因此選擇黃豆粉作為番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。

圖2 不同氮源對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on lycopene fermentation

2.3 不同油對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

分別考察了花生油、棉籽油、葵花籽油、大豆油以及菜籽油對(duì)三孢布拉霉發(fā)酵的影響。從圖3可以看出，油類均能有效促進(jìn)生物量和番茄紅素產(chǎn)量累積，其中棉籽油效果最好。Mantzouridou等［9］發(fā)現(xiàn)添加粗橄欖油和大豆油到葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，能大幅提高三孢布拉霉類胡蘿卜素含量。Vereschagina等［10］也研究發(fā)現(xiàn)添加亞油酸特別是亞麻酸含量豐富的油類能顯著提高三孢布拉霉發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素水平，其作用機(jī)理可能是外源油脂添加使絲狀真菌三酰甘油中多不飽和脂肪酸比例增加，從而增加了番茄紅素在其脂質(zhì)體中的溶解度而促進(jìn)其大量累積。棉籽油和葵花籽油中的多不飽和脂肪酸含量要比其他油類更為豐富，在本實(shí)驗(yàn)中這2種油促進(jìn)番茄紅素合成效果最好，這與上述研究結(jié)果一致。

圖3 不同油對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different oils on lycopene fermentation

2.4 接種量和正負(fù)菌比例對(duì)番茄紅素產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)三孢布拉霉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量以其正負(fù)菌比例對(duì)發(fā)酵的影響作了分析，從圖4a中可以看出當(dāng)接種量為10%時(shí)，番茄紅素的含量最高。因此在發(fā)酵時(shí)應(yīng)該選擇10%的接種量進(jìn)行發(fā)酵。另外，從圖4b中可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)正菌量少于負(fù)菌量，即兩者比例小于1時(shí)更有利于番茄紅素的合成，這是因?yàn)槿卟祭沟呢?fù)菌為番茄紅素的主要生產(chǎn)者，正菌主要起刺激性激素三孢酸合成的作用，三孢酸則在三孢布拉霉合成類胡蘿卜素過程中起重要作用［11］。同時(shí)，當(dāng)正負(fù)菌比例為 1∶5時(shí)，番茄紅素的含量最高。Varzakakou等［12］研究了三孢布拉霉正負(fù)菌比例對(duì)其累積β-胡蘿卜素的影響，其設(shè)置正負(fù)菌的比例從100∶1到1∶100，發(fā)現(xiàn)正菌量高于負(fù)菌量時(shí)番茄紅素含量降低，正負(fù)菌比例維持在1∶10時(shí)其β-胡蘿卜素的含量最高。

2.5 利用正交試驗(yàn)優(yōu)化番茄紅素發(fā)酵條件

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，外加碳源、氮源和油類分別以玉米粉、黃豆粉和棉籽油對(duì)番茄紅素的累積效果最好，本研究進(jìn)一步考察其最適濃度，同時(shí)阻斷劑2-甲基咪唑濃度對(duì)番茄紅素合成可能產(chǎn)生較大影響。本試驗(yàn)選取上述4因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果取其平均值。

2.5.1 極差分析

表2中的K1、K2、K3分別表示在各因素各水平下菌株ZY合成番茄紅素含量的總和，k1、k2、k3分別表示在各因素各水平下番茄紅素含量的平均值。用同一因素各水平下平均番茄紅素含量的極差R(極差=平均含量的最大值-平均含量的最小值)來反映各因素的水平變動(dòng)對(duì)含量影響的大小。極差大就表示該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響大，極差小就表示該因素的水平變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響小。

圖4 接種量(a)和正負(fù)菌比例(b)對(duì)番茄紅素發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of inoculum size and ratio of(+)and(-)mating type of B.trispora on lycopene fermentation

由表2得到本次實(shí)驗(yàn)因素的主次順序依次為:阻斷劑、棉籽油、玉米粉、黃豆粉。同時(shí)可以得到各因素的最佳組合為 A3B3C2D2，即玉米粉50 g/L、阻斷劑0.5 g/L、棉籽油30 g/L、黃豆粉25 g/L。按此搭配的試驗(yàn)在正交表的9次試驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)，需要做補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of orthogonal test

2.5.2 方差分析

正交試驗(yàn)的極差分析法簡便、直觀、計(jì)算量小，但不能估計(jì)試驗(yàn)誤差，即不能區(qū)分試驗(yàn)結(jié)果的差異是由各因素的水平變化而導(dǎo)致，還是由試驗(yàn)的隨機(jī)波動(dòng)而導(dǎo)致。為了解決此問題，需要對(duì)試驗(yàn)結(jié)果做方差分析。對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果采用Excel軟件做了方差分析，結(jié)果如表3所示。由表3可知各因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度，阻斷劑對(duì)結(jié)果影響最大，棉籽油次之，玉米粉再次之，而最后是黃豆粉，這個(gè)結(jié)果與極差分析的結(jié)果一致。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)分析的結(jié)果，對(duì)最佳組合A3B3C2D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。將ZY接種于該發(fā)酵培養(yǎng)基中，為保證實(shí)驗(yàn)的精確性，每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。結(jié)果顯示番茄紅素含量達(dá)到29.9 mg/g菌體干重，高于正交試驗(yàn)中最高值(27.1 mg/g)。Liu等［13］對(duì)三孢布拉霉的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化之后，其番茄紅素含量達(dá)到19 mg/g菌體干重。Wang等［5］在優(yōu)化了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件后番茄紅素的含量為11 mg/g菌體干重。Sun等［14］在培養(yǎng)基中添加2種競爭性途徑抑制劑使三孢布拉霉番茄紅素累積含量提高到4.3 mg/g。Shi等［15］在培養(yǎng)基中加入前體和代謝促進(jìn)劑后番茄紅素含量大幅提高至10 mg/g菌體干重，產(chǎn)量最高達(dá)到578 mg/L。上述研究均采用三孢布拉霉進(jìn)行番茄紅素發(fā)酵，但含量遠(yuǎn)低于本試驗(yàn)所獲的結(jié)果。除此以外，采用基因工程菌進(jìn)行番茄紅素合成和發(fā)酵優(yōu)化方面也取得了很大的發(fā)展。Alper等［16］在重組大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了番茄紅素的高產(chǎn)(220 mg/L)，在優(yōu)化了攪拌速率和pH控制策略后，番茄紅素的含量達(dá)到8.15 mg/g菌體干重，生物量達(dá)到27 g菌體干重/L。Yoon等［17］采用構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌進(jìn)行番茄紅素發(fā)酵，在優(yōu)化了代謝途徑和發(fā)酵工藝后，獲得了迄今番茄紅素在大腸桿菌中最高含量(22 mg/g菌體干重)，但由于其生物量較低，因此其產(chǎn)量僅為102 mg/L。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of verification test

3 結(jié)論

本研究對(duì)絲狀真菌三孢布拉霉產(chǎn)番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得以下幾個(gè)方面的結(jié)論。對(duì)三孢布拉霉產(chǎn)番茄紅素發(fā)酵培養(yǎng)基的幾個(gè)關(guān)鍵因素碳源、氮源、油以及接種量和正負(fù)菌比例進(jìn)行了單因素試驗(yàn)。結(jié)果顯示相對(duì)于單糖，三孢布拉霉更容易利用多糖合成番茄紅素，且以不溶性的玉米粉為佳;氮源中有機(jī)氮源效果較好，黃豆粉為最佳氮源;培養(yǎng)基中添加油類能有效促進(jìn)番茄紅素累積，以棉籽油為最佳，這可能跟其不飽和度較高有關(guān);同時(shí)，三孢布拉霉的接種量特別是接種比例對(duì)番茄紅素影響較大，接種量10%為好，正負(fù)菌比例要以負(fù)菌為主，維持在1∶5時(shí)番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最大。

同時(shí)對(duì)上述試驗(yàn)獲得的幾個(gè)重要因素進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，選擇玉米粉、黃豆粉、油類、阻斷劑進(jìn)行了4因素3水平正交試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行了極差分析和方差分析，顯示4因素的主次順序?yàn)樽钄鄤?、油、玉米粉、黃豆粉，且阻斷劑對(duì)番茄紅素合成影響顯著。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，確定了培養(yǎng)基最佳組合時(shí)番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到29.9 mg/g菌體干重。

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