杭鋒，王欽博，劉沛毅，洪青，齊曉彥，劉振民，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

2(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

凝乳酶是干酪生產(chǎn)過程中起凝乳作用的關(guān)鍵性酶，通過水解k-酪蛋白中的Phe105-Met106肽鍵導(dǎo)致牛乳凝結(jié)［1］。近年來(lái)有關(guān)凝乳酶的來(lái)源、凝乳機(jī)理及小牛皺胃酶替代物均有較詳細(xì)的報(bào)道研究［2-3］。隨著世界干酪產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大和小牛皺胃酶的短缺，微生物來(lái)源凝乳酶因其產(chǎn)量大、成本較低、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中［4-8］。目前相關(guān)微生物產(chǎn)凝乳酶及其提純研究報(bào)道多集中在 Rhizomucor spp.、Mucor spp.、Aspergillus spp.和Bacillus spp.等［9-12］，而有關(guān)Paenibacillus spp.凝乳酶及多糖類物質(zhì)對(duì)提取工藝的影響等方面研究鮮有報(bào)道。

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Paenibacillus sp.BD3526除了擁有很高的凝乳酶生產(chǎn)能力外，同時(shí)其胞外多糖合成能力也很強(qiáng)。由于發(fā)酵液中的多糖類大分子物質(zhì)在鹽析及有機(jī)溶劑沉淀過程中，易伴隨蛋白質(zhì)沉淀析出，導(dǎo)致沉淀物中多糖含量較高、黏度較大，為后續(xù)凝乳酶的分離純化帶來(lái)一定的困難。此外通過研究發(fā)現(xiàn)，高通氧環(huán)境有利于微生物胞外多糖這類生物大分子的合成［13］。本文對(duì) Paenibacillus sp.BD3526發(fā)酵過程進(jìn)行研究，通過改變搖床轉(zhuǎn)速、接種量以及發(fā)酵時(shí)間，最大程度地降低發(fā)酵上清液中的多糖含量，并利用該胞外多糖和凝乳酶在不同硫酸銨飽和度下溶解性的細(xì)微差異，實(shí)現(xiàn)凝乳酶較高的回收率，為后期的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Paenibacillus sp.BD3526(CGMCC No.8333=DSM No.28815)，從西藏羌塘草原牧民牦牛乳中分離。

1.1.2 主要儀器和試劑

凍干機(jī)12L型，Labconco公司;恒溫?fù)u床HZQX500C，上海一恒科學(xué)儀器公司;離心機(jī) D-37520，Kendro公司;黏度計(jì)R180型，ProRheo公司;分光光度計(jì)Specord205，Analytik Jena公司;小牛皺胃酶，上海阿敏生物公司;Rhizomucor miehei凝乳酶Marzyme? 150 MG，美國(guó)杜邦丹尼斯克公司;Aspergillus niger var.awamori重組凝乳酶Chy-Max?，丹麥Chris Hansen公司;脫脂奶粉，F(xiàn)onterra公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品為色譜分析純;小麥麩皮(蛋白質(zhì) 18.6%，脂肪6.20%，總碳水化合物63.9%，水分7.89%，灰分3.38%)購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);其余試劑及培養(yǎng)基均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

麩皮培養(yǎng)基:小麥麩皮質(zhì)量百分含量為2%，余量為水，裝樣量50 mL于，121℃滅菌20 min后，待用。

TYC液體培養(yǎng)基:稱取酪朊水解物(或胰胨)15.0 g，酵母膏5.0 g，L-胱氨酸0.2 g，乙酸鈉20.0 g，Na2SO40.1 g，NaCl 1.0 g，NaHPO4·12H2O 2.0 g，NaHCO32.0 g，蔗糖50.0 g，溶解于1 L蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH7.3，121℃滅菌20 min，待用。

1.3 BD3526麩皮發(fā)酵上清液制備

將類芽孢桿菌BD3526接種于無(wú)菌TYC液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)20 h后，作為種子液(約5×108CFU/mL);將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養(yǎng)基，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，于4℃、15 000 g離心15 min收集發(fā)酵上清液。

1.4 樣品凝乳酶活力測(cè)定

凝乳酶活力測(cè)定方法參照Van等人的方法并做適當(dāng)調(diào)整［14］。將脫脂奶粉以 1∶10(g∶mL)的比例配置成pH 6.0含有0.01 mol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10 min，分別加入500 μL稀釋酶液，每5 s將樣品取出并傾斜45°觀察樣品組織狀態(tài)，以形成不連續(xù)顆粒的時(shí)間計(jì)作凝乳時(shí)間。按公式(1)計(jì)算樣品中凝乳酶活力(SU/mL)，按公式(2)計(jì)算其酶活回收率RE(%)。

式中，T—凝乳時(shí)間，s;VS—脫脂乳體積，mL;VE—酶液體積，mL;D—稀釋倍率。

式中，MCA1—發(fā)酵液上清酶活，SU/mL;V1—發(fā)酵液上清體積，mL;MCA2—硫酸銨沉淀溶解后樣品酶活，SU/mL;V2—硫酸銨沉淀溶解后樣品體積，mL。

1.5 樣品總糖含量測(cè)定

參照Taylor［15］苯酚硫酸法測(cè)樣品糖含量，并做部分調(diào)整。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配制1 mg/mL的葡萄糖溶液，分別吸取 0、2、5、10、50 及 100 μL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，以蒸餾水補(bǔ)至200 μL，加入5%苯酚0.4 mL和濃硫酸2 mL，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測(cè)吸光值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=0.002x+0.043，R2=0.9984(橫坐標(biāo)為糖濃度)。

樣品糖含量的測(cè)定:分別吸取稀釋后的樣品200 μL，加入5%苯酚0.4 mL及2 mL濃硫酸，搖勻，室溫放置20 min后于490 nm測(cè)吸光值，以200 μL蒸餾水作為空白，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別測(cè)定發(fā)酵上清液和硫酸銨沉淀后溶液糖含量(mg/mL)。

糖含量回收率RP按公式(3)計(jì)算:

式中，C1—發(fā)酵上清液糖濃度，mg/mL;V1—發(fā)酵液上清體積，mL;C2—硫酸銨沉淀復(fù)溶樣品糖濃度，mg/mL;V2—硫酸銨沉淀復(fù)溶樣品體積，mL。

1.6 樣品黏度的測(cè)定

使用proRheo-R180型黏度計(jì)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速1 000 r/min，操作環(huán)境溫度10℃，分別取少量樣品溶液倒入樣品槽內(nèi)，轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)10 s后度數(shù)即為黏度值(mPa·s)。

1.7 BD3526產(chǎn)凝乳酶條件優(yōu)化

1.7.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液的影響

將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)12、24、48、72、84 h 后，取BD3526麩皮發(fā)酵液，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發(fā)酵液，并分別測(cè)定發(fā)酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.7.2 不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵上清液的影響

將種子液按2%(v/v)接種于滅菌后的麩皮培養(yǎng)基，分別在140、160、170、180、300 r/min，30 ℃搖床培養(yǎng)48 h后，取BD3526麩皮發(fā)酵液，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發(fā)酵液，并分別測(cè)定發(fā)酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.7.3 不同接種量對(duì)發(fā)酵上清液的影響

將種子液分別按體積分?jǐn)?shù)為0.4%、0.8%、1.6%、2.0%、2.4%、3.2%接種于麩皮培養(yǎng)基，30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，于4℃、15 000 g離心15 min收集上清發(fā)酵液，并分別測(cè)定發(fā)酵液上清液凝乳酶活性、糖含量及黏度值。

1.8 粗凝乳酶提取方法

按“1.7發(fā)酵BD3526產(chǎn)凝乳酶條件優(yōu)化”后的試驗(yàn)方法，收集并測(cè)量發(fā)酵上清液的總體積，在具有機(jī)械攪拌的情況下，將硫酸銨粉末緩慢加入發(fā)酵上清液中溶解，分別加至硫酸銨的濃度達(dá)到飽和度(25℃)為 50%、55%、60%、65%、70%、75% 和80%，4℃靜置2 h后，于4℃、15 000 g離心15 min，收集沉淀物，使用0.02 mol/L PBS對(duì)沉淀進(jìn)行溶解，于4℃、15 000 g離心15 min條件下去除不溶物質(zhì)，收集并測(cè)量離心上清液的MCA和體積。將沉淀上清液凍干得到BD3526凝乳酶的粗提物。

1.9 凝乳酶活力的對(duì)比

分別取60%硫酸銨沉淀凍干后粗提物及商業(yè)化凝乳酶chymosin、小牛皺胃酶、R.miehei凝乳酶各5 mg，使用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)溶解至10 mL，按“1.4樣品凝乳酶活力測(cè)定”方法，比較不同樣品之間凝乳酶活力差異。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)表示，并使用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液中的凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響如圖1所示。培養(yǎng)12～24 h時(shí)，發(fā)酵上清液中凝乳酶酶活力呈較高水平，24 h時(shí)凝乳酶活力最高達(dá)到(3 209.09±85.64)SU/mL，這與微生物蛋白酶主要在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期積累的報(bào)道相一致［16］;發(fā)酵培養(yǎng)至72 h時(shí)，發(fā)酵液中凝乳酶活力仍維持較高水平為(2 545.67±57.34)SU/mL，此時(shí)黏度及糖含量均顯著下降(P＜0.01);發(fā)酵84 h后，凝乳酶活力較低僅為(1 814.52±21.38)SU/mL。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

發(fā)酵上清液中的糖含量及黏度值隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)與凝乳酶活力一致，均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。24 h時(shí)糖含量和上清液黏度值最高，分別為(5.29±0.57)mg/mL和(15±1)mPa·s;發(fā)酵72 h后，糖含量和黏度值變化顯著，均維持在較低水平，分別為(2.24±0.62)mg/mL和(9±1)mPa·s。該結(jié)果與 Thiry［17］、Wernersson［18］和 Calik［19］的報(bào)道研究相似，通過延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，可以有效降低培養(yǎng)液內(nèi)多糖含量，減小發(fā)酵液的黏度，原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌種對(duì)多糖類物質(zhì)的進(jìn)行了消耗。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為72 h，不僅其凝乳酶活力維持較高水平，且其糖含量及黏度值均較低。

2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵上清液的影響

在接種量為2%(v/v)，培養(yǎng)溫度為30℃的情況下，搖床轉(zhuǎn)速(140～300 r/min)對(duì)發(fā)酵上清液的影響如圖2所示。

圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵上清凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.2 Effect of shaking speed on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

由圖2可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵上清液的凝乳酶活、糖含量以及黏度值均有不同程度的提高。轉(zhuǎn)速在140～160 r/min時(shí)，凝乳酶活力增加較快，糖含量和黏度值較低;當(dāng)轉(zhuǎn)速超過160 r/min后，凝乳酶活力變化不大，糖含量緩慢上升，且黏度顯著提高(P＜0.01)。轉(zhuǎn)速達(dá)到300 r/min時(shí)，發(fā)酵上清液中糖含量較高為(3.71±0.55)mg/mL，黏度為(14±1)mPa·s。原因是搖瓶培養(yǎng)中的氧傳遞系數(shù)(KLa)隨著裝液量的增加而降低、轉(zhuǎn)速的提高而增加［20］。搖床轉(zhuǎn)速過快，提高了培養(yǎng)基中溶解氧含量，可能促進(jìn)了大分子糖類物質(zhì)的產(chǎn)生［21-22］。在160 r/min時(shí)，其凝乳酶活力為(2 449.25±49.88)SU/mL，且發(fā)酵液中糖含量(2.51±0.23 mg/mL)和黏度(8±1 mPa·s)均維持較低的水平，因此，選擇該轉(zhuǎn)速作為進(jìn)一步優(yōu)化的培養(yǎng)條件。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵上清液的影響

在培養(yǎng)溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下，接種量(0.4% ～3.2%)對(duì)發(fā)酵上清液的影響如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)接種量在1.6%(v/v)時(shí)，發(fā)酵液中凝乳酶活力達(dá)到最大值;而發(fā)酵上清液的糖含量與接種量呈正相關(guān)，當(dāng)接種量超過1.6%時(shí)，糖含量明顯增加，接種量為3.2%時(shí)，糖含量為最高(3.59±0.31)mg/mL;黏度值亦隨接種量的增大而逐漸增大，在0.4%和0.8%的接種量下，黏度值較低，且均為(8±1)mPa·s，接種量超過1.6%時(shí)黏度值均高于(10±1)mPa·s。接種量的不同造成發(fā)酵上清液中糖含量和黏度發(fā)生顯著變化，原因可能是TYC種子液中帶入的蔗糖促進(jìn)了多糖的合成，使得發(fā)酵上清液中多糖積累量增多。因此，選擇0.8%(v/v)的接種量，在此條件下，發(fā)酵上清中凝乳酶活力可以達(dá)到(2 685.71±34.78)SU/mL，而糖含量和黏度均保持在較低水平。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵上清液中凝乳酶活力、糖含量和黏度的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant

2.4 優(yōu)化后發(fā)酵工藝驗(yàn)證

按照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量體積分?jǐn)?shù)為0.8%、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min、發(fā)酵時(shí)間為72 h，其余步驟參照“1.3 BD3526麩皮發(fā)酵及制備”操作，比較優(yōu)化前后凝乳酶活力、糖含量及黏度值差異，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，通過優(yōu)化發(fā)酵過程中的接種量、搖床轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵時(shí)間等因素，能獲得較高酶活(2 685.71±35.35 SU/mL);糖含量相對(duì)優(yōu)化前降低了52.32%，有效降低發(fā)酵液中的多糖含量;黏度也較優(yōu)化前(接種量體積分?jǐn)?shù)為2%)，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵時(shí)間48 h)有了明顯的降低。因此通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，可有效減少糖類對(duì)后續(xù)分離純化的干擾影響。

表1 優(yōu)化前后BD3526上清液發(fā)酵液結(jié)果比較Table 1 Comparison of the milk-clotting activity，exopolysaccharides content and viscosity in the supernatant before and after the optimization

2.5 硫酸銨飽和度對(duì)凝乳酶提取效果的影響

分別使用50%～80%飽和度的硫酸銨對(duì)優(yōu)化發(fā)酵條件制備的發(fā)酵上清液中的凝乳酶進(jìn)行鹽析沉淀，并分別測(cè)定不同飽和度硫酸銨條件下，凝乳酶活力和糖含量的回收率，以篩選出硫酸銨提取凝乳酶較佳的飽和度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 不同飽和度硫酸銨對(duì)發(fā)酵上清液中凝乳酶和多糖沉淀效果Table 2 Effect of ammonium sulfate saturation on the recoveries of milk-clotting enzyme and exopolysaccharidesin the supernatant

由表2可知，隨著硫酸銨飽和度不斷升高(50%～60%)，其凝乳酶回收率也不斷增大，當(dāng)加入硫酸銨飽和濃度超過65%時(shí)，多糖伴隨凝乳酶大量沉淀，導(dǎo)致其凝乳酶回收率逐漸降低，這有可能是發(fā)酵體系中的多糖具有懸浮和穩(wěn)定作用所致;而沉淀物的糖含量回收率則與硫酸銨飽和度呈正相關(guān)，沉淀中的糖含量隨硫酸銨飽和度的增大也不斷變大，當(dāng)硫酸銨飽和濃度超過60%，沉淀中糖含量回收率增加較快。

目前對(duì)發(fā)酵上清液的目的蛋白的提取方法較常用的有鹽析法(硫酸銨等)和有機(jī)溶劑沉淀法(乙醇、丙酮等)等，本實(shí)驗(yàn)前期采用乙醇沉淀方法(乙醇與發(fā)酵液的體積比為3∶1)可實(shí)現(xiàn)37.52% ±5.89%的回收率，但多糖的回收率達(dá)到了80%以上。本文利用60%硫酸銨沉淀法獲得了凝乳酶粗提物，其酶活回收率最高為32.08%，糖類物質(zhì)的回收率也僅為16.76%，有效避免了糖類物質(zhì)的大量沉淀，實(shí)現(xiàn)了BD3526凝乳酶和多糖的有效分離。

通過發(fā)酵條件及提取方法的優(yōu)化，將凍干所得的粗凝乳酶與目前商業(yè)化用酶進(jìn)行比較(表3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化后的樣品凝乳酶活力為(188.45±5.71)SU/mg，雖然較Hansen、Danisco等商業(yè)化凝乳酶活力低，但高于商業(yè)化小牛皺胃酶的酶活，達(dá)到了商業(yè)化應(yīng)用的水平。因而，優(yōu)化BD3526的發(fā)酵條件及提取方式，獲得較低糖含量的粗凝乳酶，對(duì)于后期酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究具有重要意義。

表3 BD3526與商業(yè)化凝乳酶活力的對(duì)比Table 3 Comparison of milk-clotting activity between commercial coagulants and BD3526 MCE

3 結(jié)論

本文對(duì)Paenibacillus spp.BD3526發(fā)酵小麥麩皮生產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，在保證凝乳酶活力未明顯降低的前提下，通過對(duì)培養(yǎng)過程中的搖床轉(zhuǎn)速、接種量以及發(fā)酵時(shí)間的改變，降低發(fā)酵上清液中的多糖類含量和黏度值。在此基礎(chǔ)上，選用合適飽和度的硫酸銨進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)凝乳酶和多糖進(jìn)行分離。結(jié)論如下:

(1)當(dāng)接種量體積分?jǐn)?shù)為0.8%、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min、發(fā)酵時(shí)間為72 h時(shí)，發(fā)酵上清液中的糖和黏度均降低到了最低值，分別為1.33 mg/mL和8 mPa·s，而上清液凝乳酶活力未顯著降低。在保證酶活力及其回收率的前提下，有效降低了發(fā)酵上清液中多糖的含量。

(2)利用該菌株胞外多糖和凝乳酶在不同硫酸銨飽和度下的溶解性差異，選擇了飽和度60%的硫酸銨提取發(fā)酵液中的凝乳酶可實(shí)現(xiàn)了較高的酶活回收率，制備的凝乳酶粗提物，其凝乳酶活力為(188.45±5.71)SU/mg，達(dá)到了商業(yè)化應(yīng)用的水平。

(3)優(yōu)化后所得的凝乳酶粗提物，糖含量少，粗酶黏度較低，便于后續(xù)凝乳酶的進(jìn)一步分離和純化。

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