劉玲，康世墨，張瑩，岳璐

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽，110866)

美拉德反應(yīng)是一種廣泛存在于食品加工貯藏等過程中的非酶糖基化反應(yīng)，也稱為“非酶褐變”或“羰氨反應(yīng)”［1］。美拉德反應(yīng)在高溫、室溫下均可發(fā)生，它不僅與食品的色香味及營養(yǎng)、安全等方面有關(guān)，更與人體健康密切相關(guān)。食品在進(jìn)行焙烤、油炸等加工時(shí)，美拉德反應(yīng)末期引發(fā)蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)［2］。研究表明，內(nèi)源性 AGEs具有體內(nèi)積聚性，已被證實(shí)與許多疾病發(fā)生有關(guān)，如與糖尿病、動(dòng)脈硬化等［3］。食源性AGEs是人體AGEs的主要來源，每天AGEs的攝入量大約是25～75 mg，是尿毒癥病人血液濃度的10～15倍，只有1/3的食源性AGEs可通過腎臟排出體外，剩余2/3保留在體內(nèi)，其中大約有1/10參與血液循環(huán)［4］。目前對抑制AGEs生成的研究主要集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，常用的AGEs抑制劑為氨基胍、ALT 711(4，5-二甲基-3-苯乙?；邕蛭寺然铮珼PTC)，但臨床試驗(yàn)表明它們對人體具有較大副作用［5］。因此，天然抑制劑的研發(fā)已受到科研人員的廣泛關(guān)注。有相關(guān)研究表明，許多具有天然生物活性的多酚類物質(zhì)，如吡哆胺、黃酮類、楊梅素等可有效抑制體內(nèi)外AGEs的生成［6-8］。酚類很容易被氧化成醌類，醌類物質(zhì)亦可以作為AGEs抑制劑，2011年Hiba等［9］人的研究表明，百里香醌對人體內(nèi)外的AGEs具有很好的抑制作用。

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)是從天然蘆薈、大黃等植物中提取出來的一種蒽醌類活性物質(zhì)，具有典型的9，10-蒽醌結(jié)構(gòu)，處于最高氧化水平，較為穩(wěn)定。醫(yī)學(xué)研究表明，大黃素具有抗癌、抗腫瘤、抗炎、抑菌、抗病毒、抗腦缺血損傷、抗氧化、瀉下等作用［10］。YAN 等［11］探討了大黃素對草魚肝細(xì)胞的抗氧化作用，并且具有清除自由基的作用。這些研究主要在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其對于食品加工過程中糖基化反應(yīng)的抑制作用未見深入報(bào)道。

本文建立賴氨酸-葡萄糖模擬反應(yīng)體系，以大黃素作為天然抑制劑，通過對糖基化模型體系反應(yīng)早期、中期和末期各個(gè)階段的產(chǎn)物變化進(jìn)行分析，探究大黃素對AGEs形成的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-賴氨酸(L-Lys)、葡萄糖(Glc)、NaH2PO4、Na2HPO4、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、鹽酸羥胺、乙酸鈉、冰乙酸均為分析純，甲醇、甲酸均為色譜純，大黃素(98%)購于西安天豐生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;F-4600熒光分光光度計(jì)，日本日立公司;D-2000 Elite制備型液相色譜儀，日本Hitachi公司;Prominence LC-20AB高效液相色譜儀，美國惠普公司;DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;00000249精密電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立Lys-Glc模擬反應(yīng)體系

將用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的摩爾濃度比為3∶1的Lys溶液和Glc溶液各取1 mL于具塞試管中，搖勻后，加入同樣用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)溶解的20 μmol/L的大黃素溶液1 mL，搖勻并置于70℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以不加抑制劑組作為空白對照。

1.3.2 果糖胺的測定

利用NBT還原法測定果糖胺，用碳酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 10.83)配制0.025 mol/L的NBT(硝基四氮唑藍(lán))試液。取各組樣品溶液1 mL，加入NBT試液4 mL，10%的醋酸溶液終止反應(yīng)，在530 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應(yīng)的吸光值。

1.3.3 GO的測定

取各組反應(yīng)樣液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入乙酸鈉溶液(15 g/L)1 mL、鹽酸羥胺溶液(2 g/L)2 mL，于50℃恒溫水浴中加熱20 min，冷卻后定容，在233 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應(yīng)的吸光值。

1.3.4 CML的測定

反應(yīng)樣液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取20 μL進(jìn)樣，用峰高表示CML含量。

液相條件:色譜柱:Waters Atlantis T3 C18色譜柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:V(0.1%甲酸)∶V(甲醇)=70∶30;流動(dòng)相流速:0.5 mL/min;柱溫:25℃;進(jìn)樣量:20 μL;運(yùn)行時(shí)間 10 min。

1.3.5 5-HMF的測定

取各組反應(yīng)樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在284 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應(yīng)的吸光值。

1.3.6 類黑精的測定

取各組反應(yīng)樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在420 nm處測其紫外吸光值，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應(yīng)的吸光值。

1.3.7 戊糖素的測定

戊糖素具有熒光特性，取各組反應(yīng)樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，在在激發(fā)波長335 nm、發(fā)射波長382 nm處測定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示AGEs含量，不加抑制劑組為對照組，測定0～6 h反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

1.3.8 熒光性AGEs的測定

利用AGEs具有熒光性的特性，在激發(fā)波長370 nm、發(fā)射波長440 nm處有最大吸收峰，取各組反應(yīng)樣液0.2 mL于試管中，用PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 8.0)稀釋至無色后，測定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度表示AGEs含量，不加抑制劑組為對照組，測定0～12 h反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，以O(shè)rigin8.0軟件繪圖。顯著性分析，P＜0.01極顯著;P＜0.05顯著，試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大黃素對果糖胺生成的抑制作用

果糖胺是美拉德反應(yīng)初期經(jīng)羰氨縮合生成的席夫堿再經(jīng)環(huán)化后生成的胺糖。由圖1可知，反應(yīng)1～4 h為果糖胺的大量生成期，在此期間果糖胺的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增加;4～10 h果糖胺逐步緩慢生成，這是因?yàn)椴糠止前穮⑴c到中期反應(yīng)生成二羰基化合物。加入大黃素后，對早期產(chǎn)物果糖胺的生成起到抑制作用，在反應(yīng)6h時(shí)，抑制率最大，達(dá)到26.14%(P ＜0.05)。

圖1 大黃素對Lys-Glc體系中果糖胺含量變化的影響Fig.1 Effect of emodin on the content changes of fructosamine in Lys-Glc system

2.2 大黃素對GO生成的抑制作用

GO為非酶糖基化反應(yīng)的初中期產(chǎn)物，是一種簡單的二羰基化合物，利用醛基成肟反應(yīng)生成的乙二醛二肟的生成量變化反映出GO的含量變化。由圖2可知，反應(yīng)1～6 h GO緩慢生成，在此期間GO的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長緩慢增加;6 h后GO大量生成，這是由于一方面果糖胺的參與促進(jìn)二羰基化合物的大量生成［12］;另一方面，底物葡萄糖自氧化也能夠生成GO，所以GO在此階段大量生成［13］。加入大黃素后，對GO的形成有明顯的抑制作用，在反應(yīng)10 h時(shí)，抑制率達(dá)到72.22%(P＜0.01)。

圖2 大黃素對Lys-Glc體系中乙二醛含量變化的影響Fig.2 Effect ofemodin on the content changes of glyoxal in Lys-Glc system

2.3 大黃素對CML生成的抑制作用

由圖3可知，反應(yīng)1～6 h CML緩慢生成，此階段主要進(jìn)行糖基化的初、中期反應(yīng)，生成大量果糖胺及少量 GO;反應(yīng)6～10 hCML大量產(chǎn)生，GO參與了CML的生成，CML的產(chǎn)生隨GO的增加而顯著上升;10 h之后CML含量減少，美拉德反應(yīng)進(jìn)入大分子黑色素生成的聚合反應(yīng)階段。大黃素對CML的生成有明顯的抑制作用，尤其反應(yīng)中后期CML大量生成，反應(yīng)10 h時(shí)抑制率達(dá)到95%(P＜0.01)。

圖3 大黃素對Lys-Glc體系中CML含量變化的影響Fig.3 Effect of emodin on the content changes of CML in Lys-Glc system

2.4 大黃素對5-HMF生成的抑制作用

5-HMF是美拉德反應(yīng)中期Amadori重排產(chǎn)物經(jīng)烯醇化后脫水形成的醛類化合物，為中期產(chǎn)物生成的另一種途徑。由圖4可知，5-HMF的生成隨反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，到4 h后不再增加。大黃素對5-HMF僅在4 h附近有較小的抑制作用。

2.5 大黃素對類黑精生成的抑制作用

類黑精是美拉德反應(yīng)中期產(chǎn)物與含氮氨基化合物進(jìn)行醛氨聚合而產(chǎn)生的末期產(chǎn)物，黑褐色，無熒光性。由圖5可知，類黑精的生成量隨反應(yīng)時(shí)間的延長先緩慢增長，4 h后快速增長，直到反應(yīng)10 h后開始減少。加入大黃素后，對類黑精有明顯的抑制作用，特別是反應(yīng)6 h時(shí)抑制率達(dá)68%(P＜0.01)。

圖4 大黃素對Lys-Glc體系中5-羥甲基糠醛含量變化的影響Fig.4 Effect of emodin on the content changes of 5-HMF in Lys-Glc system

圖5 大黃素對Lys-Glc體系中類黑精含量變化的影響Fig.5 Effect of emodin on the content changes of melanoidions in Lys-Glc system

2.6 大黃素對戊糖素生成的抑制作用

戊糖素是Amadori重排產(chǎn)物經(jīng)過脫氫、重排、交聯(lián)等一系列反應(yīng)，最終生成一種具有熒光性的糖基化終末產(chǎn)物之一。由圖6可知，戊糖素的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長先增大后減小，最后趨于不變。大黃素自身具有熒光性，但熒光值較低。體系加入大黃素后，對戊糖素沒有明顯抑制作用，但延緩了戊糖素的生成。

圖6 大黃素對Lys-Glc體系中戊糖素含量變化的影響Fig.6 Effect of emodin on the content changes of pentosidine in Lys-Glc system

2.7 大黃素對熒光性AGEs生成的抑制作用

AGEs是一種結(jié)構(gòu)多樣的化合物，其中部分AGEs具有熒光性。由圖7可知，熒光性AGEs的生成量隨反應(yīng)時(shí)間的延長先增后減。加入大黃素后，對反應(yīng)0～3 h的熒光性AGEs具有明顯的抑制作用，特別是反應(yīng)2 h時(shí)，達(dá)到最大抑制率為90%(P＜0.01);當(dāng)反應(yīng)4 h后，熒光值升高，說明大黃素不再抑制熒光性反應(yīng)，可見大黃素對戊糖素等熒光性物質(zhì)的延遲作用，也體現(xiàn)出大黃素對熒光性產(chǎn)物的延遲作用。

圖7 大黃素對Lys-Glc體系中熒光性AGEs含量變化的影響Fig.7 Effect of emodin on the content changes of fluorescent AGEs in Lys-Glc system

3 討論

對于含糖和蛋白的食品，在加工過程中能夠生成糖基化產(chǎn)物。加工過程常在高溫下進(jìn)行，由于溫度過高導(dǎo)致反應(yīng)速度過快，常常不利于觀察反應(yīng)各階段產(chǎn)物的變化，故本研究將模擬體系溫度設(shè)定為70℃。

大黃素作為一種天然抑制劑添加到非酶糖基化模擬體系中，在反應(yīng)初期階段，大黃素對由葡萄糖羰基與賴氨酸氨基縮合環(huán)化生成的果糖胺具有抑制作用。果糖胺經(jīng)Amadori重排后，經(jīng)烯醇化后再裂解成為二羰基化合物(包括GO、MGO、3-DG、乙二酸等)，進(jìn)入非酶糖基化的中期階段，大黃素對GO表現(xiàn)出明顯的抑制作用。反應(yīng)后期，二羰基化合物與氨基化合物醛氨聚合生成末期產(chǎn)物，大黃素對這些產(chǎn)物包括CML、類黑精都有較好的抑制作用。在反應(yīng)過程中，GO作為CML的前體物質(zhì)，可經(jīng)葡萄糖自氧化生成，也可經(jīng)美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物氧化生成，因此大黃素抑制糖基化的作用主要體現(xiàn)在抗氧化作用上。大黃素對美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物5-HMF的生成無明顯抑制作用，也說明了大黃素抑制糖基化作用主要表現(xiàn)在抗氧化作用上。大黃素對戊糖素?zé)o明顯抑制作用，這一結(jié)果與梁海燕等人的研究結(jié)果相似［14］，可能是由于戊糖素的生成路徑與CML有所不同。

4 結(jié)論

本研究建立了Lys-Glc模擬食品加工過程中的非酶糖基化反應(yīng)體系，通過對果糖胺、GO、CML、5-HMF、類黑精、戊糖素、熒光性AGEs的含量變化分析，明確大黃素對非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用。結(jié)果表明，大黃素對糖基化反應(yīng)的氧化產(chǎn)物及進(jìn)一步生成的中、末期產(chǎn)物具有較好的抑制作用，對具有熒光性的糖基化產(chǎn)物戊糖素和其他熒光性AGEs抑制作用不明顯，大黃素的抑制作用主要體現(xiàn)在抗氧化性上。

［1］ Martins S I F S，Jongen W M F，Boekel M A J S.A review of Maillard reaction in food and implications to kinetic modelling［J］.Trends in Food Science ＆ Technology，2000，11(9/10):364-373.

［2］ Limacher A，Kerler J，Davidek T，et al.Formation of furan and methylfuran by maillard-type reactions in model systems and food［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(10):3 639-3 647.

［3］ 李紅姣，趙忠，李巨秀.杏仁種皮黑色素抑制晚期糖基化末端產(chǎn)物的研究［J］.中國糧油學(xué)報(bào)，2015，30(2):50-56.

［4］ Zhang Q，Ames J M，Smith R D，et al.A perspective on the Maillard reaction and the analysis of protein glycation by mass spectrometry:probing the pathogenesis of chronic disease［J］.Journal of Proteome Research，2009，8(2):754-769.

［5］ Mike A R，Robert E F，Brendan K P，et al.Inhibition and breaking of advanced glycation end-products(AGEs)with bis-2-aminoimidazole derivatives［J］.Tetrahedron Letters，2015，56(23):3 406-3 409.

［6］ Yao C C，Ming S W，Tai H W，et al.Pyridoxamine ameliorates the effects of advanced glycation end products on subtotal nephrectomy induced chronic renal failure rats［J］.Journal of Functional Foods，2012，4(3):679-686.

［7］ Urios P，Kassab I，Grigorova-Borsos A M，et al.A flavonoid fraction purified from Rutaceae aurantiae(Daflon R)inhibiting AGE formation，reduces urinary albumin clearance and corrects hypoalbuminemia in normotensive and hypertensive diabetic rats［J］.Diabetes Research and Clinical Practice，2014，105(3):373-381.

［8］ Young S K，Junghyun K，Ki M K，et al.Myricetin inhibits advanced glycation end product(AGE)-induced migration of retinal pericytes through phosphorylation of ERK1/2，F(xiàn)AK-1，and paxillin in vitro and in vivo［J］.Biochemical Pharmacology［J］.Biochem Pharmacol，2015，93(4):496-505.

［9］ Jack N L，Hiba A B，Madhavi C.Inhibition of the formation of advanced glycation end products by thymoquinone［J］.Food Chemistry，2011，128(1):55-61.

［10］ 劉靜，王麗.大黃素的研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2014，25(35):3351-3354.

［11］ YAN T C，BO L，JUN X，et al.The effect of emodin on cytotoxicity，apoptosis and antioxidant capacity in the hepatic cells of grass carp(Ctenopharyngodon idellus)［J］.Fish＆ Shellfish Immunology，2014，38(1):74-79.

［12］ 周燕瓊.植物多酚抑制食品中晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成的作用機(jī)理研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2015.

［13］ 付全意.食品模擬糖化反應(yīng)過程中羧甲基賴氨酸的形成和抑制［D］.廣州:華南理工大學(xué)，2012.

［14］ 梁海燕，古德祥，木苗直秀，等.類黃酮化合物對糖基化反應(yīng)終產(chǎn)物AGE的抑制作用［J］.天然產(chǎn)物研發(fā)與開發(fā)，2002，14(2):14-18.