裴敏，王強(qiáng)，羅瑋，顧秋亞，鞏尊洋，余曉斌

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫，214122)

番茄紅素是一種天然的功能性色素，分子式為C40H56，屬于直鏈碳?xì)浠衔铮?1個(gè)碳碳共軛雙鍵和2個(gè)非共軛雙鍵，這種特定的不飽和分子結(jié)構(gòu)，賦予了番茄紅素極強(qiáng)的自由基清除能力［1］。番茄紅素作為食品添加劑，動(dòng)物飼料補(bǔ)充劑，廣泛用于藥物和化妝品領(lǐng)域，對(duì)某些癌癥和慢性疾病具有一定的治療作用［2-4］。目前，番茄紅素的合成主要有3種方法，即化學(xué)合成法、天然提取法和微生物合成法?；瘜W(xué)合成的番茄紅素由于副產(chǎn)物較多［5］，限制了產(chǎn)品質(zhì)量和使用范圍;天然提取法提取率低、成本高、價(jià)格也相對(duì)較高，限制了其大規(guī)模合成;而利用絲狀真菌三孢布拉霉合成番茄紅素是一種極具工業(yè)化潛力的方法，在發(fā)酵過程中添加番茄紅素環(huán)化酶抑制劑即可得到產(chǎn)物番茄紅素。Blakeslea trispora隸屬毛霉目笄霉科，有正負(fù)菌之分，負(fù)菌是番茄紅素主要生產(chǎn)菌，正菌作為配對(duì)菌與負(fù)菌混合發(fā)酵可產(chǎn)生性激素三孢酸，顯著促進(jìn)番茄紅素的合成。其合成的番茄紅素為全反式結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)周期短、成本較低、生產(chǎn)過程易于控制且產(chǎn)物易于提取，具有巨大的市場(chǎng)前景。國(guó)外采用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量已達(dá)到3.4 g/L［6］，而國(guó)內(nèi)的番茄紅素產(chǎn)量基本在1.5 g/L左右，與國(guó)外仍有較大差距，限制了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

近年來產(chǎn)番茄紅素基因工程菌研究相對(duì)較多，但其最大缺點(diǎn)是外源載體不穩(wěn)定、易丟失;番茄紅素產(chǎn)量仍然較低。相對(duì)于基因工程育種，傳統(tǒng)微生物菌株選育操作簡(jiǎn)單，更適用于絲狀真菌的選育過程。

離子束注入誘變技術(shù)是最近20年發(fā)展起來的一種生物誘變技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程和生物品種改良。研究者普遍認(rèn)為，低能離子與生物物質(zhì)之間相互作用有能量、動(dòng)量、質(zhì)量和電荷等方面的效應(yīng)，可引起靶分子(或原子)的電離和激發(fā);此外，等離子束注入誘變有物理、化學(xué)等誘變方法的特點(diǎn)，而且生理?yè)p傷小、突變率高、突變譜廣，并有一定的重復(fù)性和方向性［7-8］。三孢布拉霉菌的菌絲體和孢子均為多核體，厚壁多核的特性增加了誘變的困難，需經(jīng)多次誘變或復(fù)合誘變才能取得較好的效果。低能離子束可誘變微生物產(chǎn)生比較高的特異生化突變率，本文選用N+束對(duì)B.trispora進(jìn)行誘變選育。

1 材料和方法

1.1 菌株和種子培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用的菌株是三孢布拉霉菌(B.trispora)NRRL 2895正菌和NRRL2896負(fù)菌。正負(fù)菌孢子接種在5°麥汁平板上，于25℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d，待孢子長(zhǎng)滿整個(gè)平板后，在每個(gè)平板中加入10 mL已滅菌的蒸餾水沖洗孢子，收集孢子懸液并使用滅菌的玻璃珠的錐形瓶中將孢子充分打散，并調(diào)整孢子濃度。正、負(fù)菌孢子濃度分別為5.0×105個(gè)/mL和1.0×106個(gè)/mL，以10%的接種量接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在25℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。種子培養(yǎng)基含有30 g/L玉米粉，50 g/L大豆粉，1.5 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O 和0.002 g/L VB1，pH為6.5，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

待種子液黏稠后以10%(v/v)的接種量接種到含有25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，正負(fù)菌的接種比例為1∶5(v/v)。發(fā)酵培養(yǎng)基含有50 g/L玉米粉，25 g/L大豆粉，40 g/L棉籽油，1.5 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O 和 0.002 g/L VB1，pH調(diào)為6.5，然后121℃高壓蒸汽滅菌20 min。在25℃、180 r/min下培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵48 h時(shí)向錐形瓶中加入0.3 g/L的環(huán)化酶抑制劑2-甲基咪唑［9］，120 h后結(jié)束發(fā)酵，然后離心發(fā)酵物收集菌體并測(cè)定菌體干重和番茄紅素含量。

1.3 篩選平板的準(zhǔn)備

在5°的麥汁中加入0.005 g/L的洛伐他汀，20 g/L的瓊脂粉和0.5 g/L的乳化劑OP-10，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。制備好的平板應(yīng)避光冷藏待用。

1.4 番茄紅素高產(chǎn)菌的誘變選育

1.4.1 N+注入誘變

取0.1 mL的負(fù)菌孢子懸浮液均勻涂布在無菌培養(yǎng)皿上，并以無菌風(fēng)吹至干燥。注入能量為10 keV，注入量分別為0(對(duì)照)、3.0 ×1015、6.0 ×1015、9.0 ×1015、1.2 × 1016、1.5 × 1016、1.8 × 1016個(gè)/cm2。離子注入室真空度為10-2Pa，電流為400 μA，每次以5 s脈沖式注入，間隔30 s。離子注入結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，用0.5 mL的無菌生理鹽水洗下孢子，并均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d以長(zhǎng)出單菌落。

1.4.2 存活率和突變率的計(jì)算

存活率的計(jì)算公式為:存活率/%=(C1/C0)×100，C1指處理組在篩選平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù);C0指對(duì)照組在篩選平板長(zhǎng)出上的菌落數(shù)。正突變率/%=(M1/M0)×100。負(fù)突變率/%=(M2/M0)×100，M1指篩選平板上長(zhǎng)出的呈紅色和深黃的單菌落數(shù);M2指篩選平板上長(zhǎng)出的呈白色和淺黃的單菌落數(shù);M0指生長(zhǎng)在篩選平板上所有的單菌落數(shù)。

1.4.3 高產(chǎn)番茄紅素三孢布拉霉菌的篩選

從篩選平板上挑出菌絲呈紅色或者比原始菌株菌絲更黃的單菌落，在不含發(fā)酵液的麥汁平板上傳代4～5次以挑選出性狀穩(wěn)定的菌株。分別將這些菌株接種到篩選平板的一側(cè)，在另一側(cè)接種正菌菌株，培養(yǎng)3 d后觀察正負(fù)菌接合區(qū)域的顏色，根據(jù)接合區(qū)域的顏色深淺確定番茄紅素的產(chǎn)量的高低，然后挑選接合帶顏色深的負(fù)菌進(jìn)行傳代。挑選出的負(fù)菌與正菌需進(jìn)行搖瓶發(fā)酵以進(jìn)一步確定番茄紅素的產(chǎn)量。

1.5 番茄紅素的提取和分析

發(fā)酵結(jié)束后收集發(fā)酵液離心，將得到的菌絲置于40℃的真空干燥箱干燥24 h，取出置于研缽中，加入適量石油醚研磨，多次抽提直至菌絲無色。取適量提取液稀釋，在502 nm測(cè)定此稀釋液的吸光度［10］，對(duì)比番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算番茄紅素含量。

1.6 總RNA的提取和電泳分析

取0.1 mL負(fù)菌孢子液接種到種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，離心種子液，取適量菌絲體于研缽(-20℃預(yù)冷)中，倒入適量液氮，迅速研磨成粉狀。之后按照柱式真菌總RNA抽提純化試劑盒(上海生工)說明書進(jìn)行RNA的提取。提取結(jié)束后，凝膠電泳分析所提取的RNA的質(zhì)量，電泳后應(yīng)出現(xiàn)明顯的3條帶，依次是28 s、18 s、5 s條帶。若5 s帶不發(fā)生降解，且18 s條帶的亮度是5 s條帶亮度的2倍左右，無拖尾現(xiàn)象，即可用于后續(xù)試驗(yàn)。

將出發(fā)菌株和高產(chǎn)番茄紅素突變株分別與正菌共培養(yǎng)發(fā)酵48 h后提取總RNA，并電泳分析所提取RNA的質(zhì)量。

1.7 反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

反轉(zhuǎn)錄在Techne TC-5000 PCR儀器上進(jìn)行，試劑盒為AMV第一鏈cDNA合成試劑盒。反應(yīng)體系與反應(yīng)程序按試劑盒說明書設(shè)定。反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存或進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

RT-PCR所用的試劑盒是SGExcel Fast SYBR Miture，所用儀器為 Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量定量 PCR儀。RT-PCR 反應(yīng)體系:cDNA(0.1 μL)，引物(10 μm，0.5 μL)，RNase free ddH2O(10.5 μL)，12.5 μL的SGExcel FastSYBR Miture(含有Fast Taq DNA聚合酶、PCR Buffer、dNTPs、SYBR GreenⅠ熒光染料和Mg2+)，最終體積為25 μL。反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，20 s;變性95℃，30 s;退火60℃，30 s;35～40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析:95℃，15 s;60℃，1 min;95℃，15 s;60℃，15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)以確保數(shù)據(jù)的可信度。反應(yīng)結(jié)束后，為了確定產(chǎn)物只有目標(biāo)片段，分析溶解曲線并將反應(yīng)液電泳鑒定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中采用的內(nèi)參照基因?yàn)檠由煲蜃觮ef1［11］，定量PCR結(jié)果采用 2-ΔΔCt分析［12］，在定量 PCR 中所用基因hmgR、carB、carRA和tef1的引物見表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物Table 1 Oligonucleotide primers used in this paper

2 結(jié)果與討論

2.1 存活率曲線和誘變劑量的選擇

如圖1所示，不同劑量的N+束對(duì)入對(duì)B.trispora(-)菌的存活率和突變率影響明顯。離子注入劑量從0上升到6.0×1015個(gè)/cm2時(shí)B.trispora菌存活率急劇下降，而在注入劑量從9.0×1015個(gè)/cm2增加到1.2×1016個(gè)/cm2時(shí)存活率卻有小幅度上升，且在劑量為1.2×1016個(gè)/cm2達(dá)到最大，隨著注入劑量再增加存活率又下降，呈現(xiàn)出離子束注入誘變特有的“馬鞍型”曲線，而一般電離輻射造成的劑量-效應(yīng)曲線為“指數(shù)型”［13］。離子注入生物體是集多種效應(yīng)于一體的聯(lián)合作用過程，其對(duì)生物體的作用可產(chǎn)生更廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。馬鞍型存活曲線體現(xiàn)了等離子束注入細(xì)胞后經(jīng)物理、化學(xué)和生物等一系列作用過程后產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)［14］。在進(jìn)行誘變育種時(shí)，增加正突變率相對(duì)容易獲得高產(chǎn)菌株。由圖1可知，注入劑量為0～6.0×1015個(gè)/cm2時(shí)正負(fù)突變率均較低;劑量為9.0 ×1015個(gè)/cm2到1.2 ×1016個(gè)/cm2時(shí)，可獲得較高的正突變率，隨著誘變劑量的加大，正突變率也逐漸下降。

圖1 N+注入劑量對(duì)B.trispora(-)存活率和誘變率的影響Fig.1 Effect of N+ implantation dose on the survival rate and mutation rate of B.trispora(-)

2.2 高產(chǎn)番茄紅素突變株的篩選

N+束注入后誘變后的孢子液涂布在篩選平板上，3天左右長(zhǎng)出單菌落，挑選菌絲呈紅色或深黃色的菌落傳代培養(yǎng)。淺黃色突變株產(chǎn)較少類胡蘿卜素，有可能是類胡蘿卜素合成前期由于基因突變某些酶活性較低;紅色菌落則是由于番茄紅素環(huán)化酶缺失或活性較弱，積累較多的番茄紅素;深黃色菌落含有較多的類胡蘿卜素或者其合成前體。挑選出來的菌株與正菌在麥汁平板上進(jìn)行接合試驗(yàn)，接合區(qū)域的顏色呈明亮的黃色到深紅色，差異較明顯。挑選深黃色菌落或紅色菌落在平板上傳代5～6次以確定其遺傳性狀穩(wěn)定性。最終選育出8株突變菌，命名為2a、2b、3d、4c、5a、7c、7f和 8d。

圖2 出發(fā)菌株和部分突變株與正菌的配對(duì)接合試驗(yàn)Fig.2 The mating test of parent strain and partial mutants with the(+)strain respectively

2.3 高產(chǎn)番茄紅素突變株的產(chǎn)量

挑選出的高產(chǎn)番茄紅素負(fù)菌株和出發(fā)菌株分別與正菌共培養(yǎng)確定菌株產(chǎn)番茄紅素的能力。本文選擇了8株負(fù)菌進(jìn)行試驗(yàn)，最終的番茄紅素產(chǎn)量和菌體干重如圖3所示，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明，N+注入對(duì)三孢布拉霉負(fù)菌正誘變效應(yīng)明顯。誘變后，菌株4c發(fā)酵96 h的最高產(chǎn)量為25.97 mg/g，干重為56.8 g/L，與出發(fā)菌株相比產(chǎn)量提高了39%。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雖然在麥汁平板上正負(fù)菌結(jié)合試驗(yàn)時(shí)接合區(qū)域的菌絲顏色較深，但進(jìn)行共培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)番茄紅素的產(chǎn)量并沒有達(dá)到預(yù)期值，同時(shí)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的顏色并不是先前的米色或淡黃色，而是呈淺紅色或深紅色，這說明菌體發(fā)生了自溶，可能是該菌株不適合液體發(fā)酵條件或培養(yǎng)基成分。

圖3 B.trispora(-)突變株的番茄紅素產(chǎn)量和生物量Fig.3 Lycopene content and biomass of B.trispora mutants obtained by N+ implatation

2.4 高產(chǎn)番茄紅素的遺傳穩(wěn)定性分析

為考察突變株高產(chǎn)特性的穩(wěn)定性，將突變株4c傳代5次并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，如表2所示，突變株4c具有穩(wěn)定的高產(chǎn)番茄紅素的能力。

表2 4c菌株的遺傳穩(wěn)定性Table 2 Lycopene concentration stability of the mutant 4c during generations

2.5 番茄紅素合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA(HMG-CoA)還原酶(hmgR編碼)，八氫番茄紅素脫氫酶(carB編碼)，番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素合成酶(carRA編碼)是B.trispora番茄紅素合成途徑中的關(guān)鍵酶［15］。HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA不可逆生成類異戊二烯合成的前體甲羥戊酸，這是類異戊二烯合成的限速步驟。增強(qiáng)hmgR的表達(dá)可提高細(xì)胞內(nèi)HMG-CoA還原酶的含量，進(jìn)而提高番茄紅素的產(chǎn)量。carB和carRA是類胡蘿卜素合成途徑中所特有的，并控制著類胡蘿卜素合成途徑［15］，因此本文分析了番茄紅素合成過程中這3個(gè)關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。

誘變后番茄紅素的產(chǎn)量有明顯提高，其原因在于類胡蘿卜素合成過程中前體或中間代謝物合成水平的增加。如圖4所示，誘變后高產(chǎn)B.trispora(-)菌株的番茄紅素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量有了明顯提高，與出發(fā)菌株相比較，hmgR、carB和carRA的表達(dá)量分別提高了2.2倍、2.35倍和2.16倍。為進(jìn)一步驗(yàn)證番茄紅素產(chǎn)量的提高與合成番茄紅素關(guān)鍵基因的表達(dá)水平提高有關(guān)，在正負(fù)菌共培養(yǎng)發(fā)酵48 h時(shí)，對(duì)3個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，與出發(fā)菌株相比，hmgR、carB和carRA的表達(dá)量分別提高了2.0倍、1.52倍和1.35倍。hmgR的轉(zhuǎn)錄水平略有所下降，有可能是因?yàn)榘l(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)基成分并沒有種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分高。Tang Qiong等［16］在正負(fù)菌共培養(yǎng)30 h時(shí)加入30 mg/L的酮康唑處理24 h，hmgR和carRA的表達(dá)量分別提高了3.5倍和3倍，β-胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到0.41 mg/g，提高了140%;而André D.Schmidt等［17］研究發(fā)現(xiàn)，正負(fù)菌共同培養(yǎng)48 h時(shí)carB和carRA的表達(dá)量分別提高了148倍和128倍，這是因?yàn)檎?fù)菌混合培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生性激素三孢酸，強(qiáng)烈誘導(dǎo)類胡蘿卜素合成酶基因的表達(dá)，也說明了類胡蘿卜素的合成主要受到性激素的影響;在高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株分別與正菌共同培養(yǎng)時(shí)，hmgR、carB和carRA的表達(dá)量差異則不是特別顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，N+注入后菌體內(nèi)發(fā)生了復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，可認(rèn)為離子束注入后產(chǎn)生的一系列物理化學(xué)等原初反應(yīng)既可能會(huì)對(duì)保護(hù)酶(CAT、SOD)合成從轉(zhuǎn)錄到翻譯等不同水平上進(jìn)行調(diào)控，也可能會(huì)作用于它們的固有酶結(jié)構(gòu)和活性中心的空間構(gòu)象，從而導(dǎo)致酶活改變。N+注入后高產(chǎn)負(fù)菌突變株以及負(fù)菌株與正菌共培養(yǎng)48 h后番茄紅素合成關(guān)鍵基因hmgR、carB和carRA表達(dá)水平不同程度地提高，因此，N+束注入后產(chǎn)生大量的自由基以及應(yīng)激產(chǎn)生大量的保護(hù)酶，可能在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一系列物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核作用于hmgR、carB和carRA基因，基因結(jié)構(gòu)或者基因的表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)生某種可穩(wěn)定遺傳的變化，提高了 hmgR、carB和carRA基因的轉(zhuǎn)錄水平，由此實(shí)現(xiàn)番茄紅素的積累。

圖4 誘變后4c菌株單獨(dú)培養(yǎng)48 h和與正菌共培養(yǎng)48 h基因hmgR、carB和carRA的表達(dá)量Fig.4 Relative quantification by real-time PCR of hmgR，carB and carRA gene transcripts in 4c strain cultured for 48 h period in breeding cultures and cultured with B.trispora(+)strain for 48 h period in submerged cultures respectively

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用新型離子束誘變技術(shù)，經(jīng)過誘變篩選、平板篩選和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)獲得了高產(chǎn)番茄紅素菌株。hmgR、carB和carRA是三孢布拉霉菌合成番茄紅素的關(guān)鍵基因，本文研究了N+束注入后高產(chǎn)菌株與出發(fā)菌株關(guān)鍵基因表達(dá)水平的變化，誘變后關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄水平均有所提高，初步探究了離子束誘變后的高產(chǎn)機(jī)制。目前用于食品和醫(yī)藥行業(yè)的番茄紅素產(chǎn)品仍依賴天然提取，因此市場(chǎng)上番茄紅素價(jià)格相對(duì)偏高。ZHU等［18］構(gòu)建篩選出1株高產(chǎn)番茄紅素大腸桿菌，在2.5 L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到1.44 g/L;在真核宿主中番茄紅素最高產(chǎn)量達(dá)到16 mg/g［19］，但工程菌在從實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)到工業(yè)化生產(chǎn)過程中仍有諸多問題待解決。三孢布拉霉菌是目前唯一應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)天然番茄紅素的真菌，在發(fā)酵過程中添加Fe3+［20］，液體石蠟［21］等引起氧化應(yīng)激，實(shí)現(xiàn)番茄紅素的積累;但也存在著高產(chǎn)株難以篩選、產(chǎn)量低、菌種易退化、番茄紅素環(huán)化酶抑制劑的添加與殘留等問題，在建立新型高產(chǎn)株篩選策略、尋找低毒無害環(huán)化酶抑制劑等方面需要大量的研究，這將對(duì)推進(jìn)番茄紅素在工業(yè)化生產(chǎn)中的發(fā)展有重要意義。

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