龐庭才，胡上英，甘紅

1(欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州，535099)2(欽州學(xué)院電子與信息工程學(xué)院，廣西欽州，535099)

紅菇(Russula)屬真菌屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、紅菇目、紅菇科。國(guó)際上已報(bào)道的紅菇屬真菌有 300多種，我國(guó)有記載的90余種，其中多數(shù)可食用且具有藥用功能［1］。長(zhǎng)期以來被作為一種名貴的藥食兼用真菌，具有補(bǔ)血壯體、延緩衰老、養(yǎng)血養(yǎng)顏、防癌抗癌、降低膽固醇等多種保健功效［2-4］。紅菇色素是一種水溶性紅色色素，它既是某些紅菇種的特征之一，也是紅菇分類鑒定的重要依據(jù)。已有研究表明，正紅菇的色素由紅紫色素和黃色素2個(gè)組分組成，其中紅紫色素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)含有較高比例的—OH和雙鍵［5］。Froede等［6］從淡黃紅菇(R.flavida)中發(fā)現(xiàn)一種新型的三萜醌甲基色素。當(dāng)前對(duì)天然色素的提取方法主要有:溶劑浸提法、酶提取法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法、微波提取法。超聲波提取技術(shù)作為一種新興的應(yīng)用技術(shù)，近年來已被廣泛應(yīng)用于某些天然成分的提?。?］，與傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，具有操作簡(jiǎn)便快捷、速度快、提取率高等明顯的優(yōu)點(diǎn)［8］。目前，利用超聲波輔助提取紅菇色素及其穩(wěn)定性和抗氧化性研究尚未見報(bào)道。本文以野生紅菇為原料，采用超聲波輔助提取紅菇色素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝參數(shù)，并對(duì)紅菇色素在不同溫度、光照、食品添加劑以及常見金屬離子等存在下的穩(wěn)定性以及對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的清除能力進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅菇，購(gòu)于欽州市浦北縣;無水乙醇、濃 HCl、NaOH等，均為分析純。

JY98-IIIDN超聲波破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司;EL204電子天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司;ERZ-A5110A鼓風(fēng)干燥箱，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;UV-3200紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;H1850臺(tái)式離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 操作要點(diǎn)

1.2.1.1 原料預(yù)處理

將紅菇清理后，置于80℃烘干，粉碎并過100目篩，于干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 最大吸收波長(zhǎng)的選擇

稱取1.0 g紅菇粉置于50 mL燒杯中，加入20 mL pH值為3的體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸沒，超聲提取30 min，抽濾后取5 mL濾液定容至50 mL容量瓶中，在190～600 nm內(nèi)進(jìn)行掃描，確定紅菇色素最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 紅菇色素最佳提取工藝條件的確定

1.2.2.1 料液比的測(cè)定

在乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、超聲波功率300 W、提取時(shí)間30 min的條件下，考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL)，對(duì)紅菇色素提取率的影響。

1.2.2.2 超聲波時(shí)間的選擇

在料液比1∶20(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、超聲波功率300 W的條件下，考察不同超聲波時(shí)間(20、30、40、50、60 min)，對(duì)紅菇色素提取率的影響。

1.2.2.3 乙醇濃度的選擇

在料液比1∶20(g∶mL)、超聲波功率300W、提取時(shí)間30min的條件下，考察不同體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)乙醇溶液，對(duì)紅菇色素提取率的影響。

1.2.2.4 超聲波功率的選擇

在料液比1∶20(g∶mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、提取時(shí)間30 min的條件下，考察不同超聲波功率(350、400、450、500、550 W)，對(duì)紅菇色素提取率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇一定料液比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、超聲功率作為試驗(yàn)因素，采用L16(45)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定紅菇超聲提取的最佳工藝條件。正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.4 提取率的計(jì)算

在最佳提取條件下，分別多次提取一定量的紅菇，直到提取液的吸光度值為基本為零，可認(rèn)為已經(jīng)把紅菇色素全部提出。收集各次提取液，并測(cè)定第一次體積(V1)和吸光度(A1)，然后合并各次提取液，測(cè)出其總體積(V總)和總吸光度(A總)［9］。

提取率的計(jì)算公式為:

提取率 /%=［V1×A1/(V總×A總)］×100(1)

1.2.5 紅菇色素的穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 溫度對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等量的紅菇色素稀釋液5 mL，分別在30、40、60、80、100℃下采用冷凝回流法，水浴20 min后冷卻至室溫，在波長(zhǎng)201 nm處測(cè)其吸光度。

1.2.5.2 光照對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等量的紅菇色素稀釋液5 mL，分別置于黑暗、自然光照射條件下靜置5 d，每天在波長(zhǎng)201 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5.3 兩種食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等量的色素稀釋液5 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、5%、10%、20%、30%的葡萄糖、檸檬酸各2 mL，靜置1 h，在波長(zhǎng)201 nm處測(cè)定吸光度。

1.2.5.4 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

取等量的色素稀釋液5 mL，分別加入不同濃度的金屬離子 Na2+、K+、Cu2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+溶液，金屬離子的濃度為 0.001、0.005、0.010、0.050、0.100 mol/L，靜置1 h，在波長(zhǎng)201 nm處測(cè)其吸光度。

1.2.6 紅菇色素的抗氧化性研究

1.2.6.1 清除羥自由基(·OH)活性測(cè)定

在15 mL的具塞試管中分別加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，再分別加入 1 mL 不同濃度(0.1、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL)紅菇色素溶液，最后加入1 mL H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃水浴反應(yīng)30 min后，8 000 r/min離心5 min，取上清液在510 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水代替H2O2作為對(duì)照組，以蒸餾水代替樣品作為空白［10］。

·OH清除率/%=［A0-(Ai-Ai0)/A0］×100

式中:Ai，為樣品組;Ai0，以蒸餾水代替H2O2的對(duì)照組;A0，以蒸餾代替樣品的空白。

1.2.6.2 清除超氧陰離子自由基(O2-·)活性的測(cè)定

取4.5 mL Tris-HCl緩沖液，加入不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.07、0.10 mg/mL)的紅菇色素溶液2 mL在25℃恒溫水浴中放置20 min后，加入0.3 mL的25℃預(yù)熱的鄰苯三酚溶液，振蕩器混勻，在25℃水浴中反應(yīng)4 min，加入6 mol/L HCl終止反應(yīng)，在325 nm測(cè)吸光度，以蒸餾水作為對(duì)照，計(jì)算樣品對(duì)O2-·的清除率［11］。

O2-·清除率/%=V對(duì)照-V樣品/V對(duì)照×100

式中:V樣品，加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率;V對(duì)照，加入蒸餾水后鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.6.3 清除二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)活性的測(cè)定

量取 2 mL 不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的紅菇色素溶液，分別加入2 mL的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定吸光度，以2 mL的樣品溶液加入2 mL的無水乙醇作對(duì)比，以2 mL的DPPH溶液加入2 mL蒸餾水中作為空白，計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率［12］。

式中:Ai，DPPH溶液+樣品溶液的吸光度值;Ai0，樣品溶液+無水乙醇的吸光度值;A0，DPPH溶液+蒸餾水。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

圖1 紅菇色素的紫外可見光光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of the pigment from Russula

以紅菇色素吸收的波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以不同波長(zhǎng)下的吸光度為縱坐標(biāo)，在不同波長(zhǎng)下的吸光度如圖1所示，可知紅菇色素最大吸收波長(zhǎng)為201 nm。

2.2 紅菇色素最佳提取工藝條件的確定

2.2.1 料液比的確定

由圖2可知，料液比為1∶10時(shí)，紅菇色素提取率為45.05%，隨著液料比的增大，料液比1∶30時(shí)提取率達(dá)到最大值(61.45%)，之后隨著料液比增至1∶50時(shí)，提取率反而有所降低(58.05%)。這是因?yàn)榛瘜W(xué)位差(濃度差)是該過程的推動(dòng)力［13］。一方面，隨溶劑用量的增加，紅菇粉末與溶劑的接觸界面增大，從而提高了傳質(zhì)的效率，使得紅菇色素提取完全;另一方面，溶劑的量過大時(shí)將紅菇內(nèi)多糖等其他物質(zhì)也浸提出來，從而影響了紅菇色素的提取。因此，從節(jié)約成本等方面考慮，選取的料液比為1∶30(g∶mL)。

圖2 料液比對(duì)紅菇色素提取效果的影響Fig.2 Effect of the liquid-solid ratio on the absorption

2.2.2 超聲時(shí)間的確定

由圖3可知，超聲時(shí)間為20 min時(shí)，紅菇色素提取率為48.33%，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)至50 min，提取率達(dá)到最大值(64.46%)，之后隨著超聲時(shí)間繼續(xù)增加，提取率反而出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榧t菇色素在50 min之前基本都溶出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，色素的積累越來越多，但超過50 min，超聲波的空化作用和長(zhǎng)時(shí)間的高溫破壞了色素的結(jié)構(gòu)，使吸光度減?。?4］。因此，選擇超聲提取時(shí)間為50 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)紅菇色素提取效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic application time on the absorption

2.2.3 乙醇濃度的確定

從圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)35%時(shí)，紅菇色素提取率為55.86%，隨著乙醇濃度的增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)45%時(shí)提取率達(dá)到最大值(61.06%)，之后隨著乙醇濃度繼續(xù)增大，紅菇色素提取率則逐漸下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)75%時(shí)，提取率最低達(dá)到50.89%。這是因?yàn)樯厥怯幸欢O性的化合物，根據(jù)相似相溶原理，當(dāng)提取劑的極性與此色素的極性更加接近時(shí)，吸光度就最大［15］;反之則逐漸減小。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇為45%。

圖4 乙醇濃度對(duì)紅菇色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the absorption

2.2.4 超聲功率的確定

由圖5可知，超聲功率在350～450 W時(shí)，隨著超聲功率的增大，紅菇色素提取率從54.03%增至63.91%(最大值);當(dāng)超聲功率為450 W之后，提取率則呈明顯下降趨勢(shì)。這是由于超聲功率過高，超聲波對(duì)紅菇的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用，使色素的構(gòu)象發(fā)生改變;同時(shí)由于超聲功率過高，超聲波的熱效應(yīng)導(dǎo)致提取溶液溫度升高，造成色素不穩(wěn)定而部分分解［16］，使紅菇色素浸提液的提取率降低。因此，超聲功率選擇為450 W。

圖5 超聲功率對(duì)紅菇色素提取效果影響Fig.5 Effect of ultrasonic application power on the absorption

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比、乙醇濃度、超聲功率和超聲時(shí)間4個(gè)因素，進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定最佳工藝條件。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

由表2可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)?超聲功率(D)＞料液比(A)＞乙醇濃度(C)＞超聲時(shí)間(B)，最佳工藝參數(shù)為A3B3C1D4，即料液比1∶40(g∶mL)，超聲時(shí)間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，超聲功率550 W。在此條件下進(jìn)行最優(yōu)方案的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到紅菇色素提取率為69.35%。

表3 方差分析表Table3 Analysis of various

為各因素對(duì)紅菇色素提取效果的影響進(jìn)行方差分析，由表3知，料液比(A)、乙醇濃度(C)、超聲功率(D)對(duì)超聲波輔助提取紅菇色素的影響達(dá)到了顯著的水平(P＜0.05)，表明料液比、乙醇濃度、超聲功率是影響紅菇色素提取的最主要影響因素;超聲時(shí)間(B)對(duì)紅菇色素提取效果的影響不顯著(P＞0.05)。

2.4 紅菇色素的穩(wěn)定性研究

2.4.1 溫度對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響

由圖6可知，30～60℃時(shí)，吸光度隨著溫度的升高從0.683增至0.793;60～100℃時(shí)，吸光度從0.793急劇降至0.479，可以明顯看出高溫對(duì)色素有顯著的破壞作用。這因?yàn)樵谀骋粶囟确秶鷥?nèi)，隨著溫度的升高，有利于分子的運(yùn)動(dòng)和色素在各相中的傳質(zhì)，從而使更多的色素溶解，但當(dāng)溫度超過60℃時(shí)，較高的溫度會(huì)導(dǎo)致色素的分解，不利于更多的色素溶于提取劑［17］。因此，紅菇色素應(yīng)該在較低溫度下保存和使用。

圖6 溫度對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on stability of Russula pigments

2.4.2 光照對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響

由圖7可知，在黑暗、自然光條件下，放置5 d的紅菇色素吸光度均有所下降，但在黑暗條件下1～5 d的紅菇色素溶液的吸光度從0.528下降至0.460，整體下降幅度較小，其顏色也幾乎沒有變化;而在自然光照射條件下，該色素溶液的吸光度在2 d內(nèi)迅速下降至0.316，顏色褪色較為明顯，之后下降趨勢(shì)穩(wěn)定。由此可見，該色素應(yīng)該在避免光照條件下進(jìn)行生產(chǎn)、保存和使用。

圖7 光照對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of light on stability of Russula pigments

2.4.3 食品添加劑對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

由圖8可知，食品添加劑葡萄糖對(duì)紅菇色素吸光度的影響比較小，而隨著檸檬酸濃度的增加，吸光度逐漸降低，原因是檸檬酸對(duì)色素具有減色作用且隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。因此，表明在不同濃度葡萄糖條件下，紅菇色素仍可以穩(wěn)定存在;而當(dāng)檸檬酸濃度超過5%時(shí)，紅菇色素的穩(wěn)定性較差。

圖8 食品添加劑對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of food additives on stability of Russula pigments

2.4.4 金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性的影響

圖9 金屬離子對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of metalions on on stability of Russula pigments

由圖9可知，不同濃度的金屬離子對(duì)紅菇色素的穩(wěn)定性有不同程度的影響，其中，不同濃度K+、Cu2+對(duì)紅菇色素的穩(wěn)定性影響較大，Mg2+、Zn2+、Ca2+濃度在超過0.010 moL/L時(shí)對(duì)紅菇的穩(wěn)定性影響較大，而Na+對(duì)紅菇色素的穩(wěn)定性影響均較小。這可能是這些金屬離子與紅菇色素中的某個(gè)基團(tuán)結(jié)合后，可使色素的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，并且具有相當(dāng)大的增色效果［18］。說明在紅菇色素生產(chǎn)和使用過程中要盡量避免含銅、鎂等容器接觸，以及對(duì)溶劑中的鉀、鋅、鈣含量的要求也比較高。

2.5 紅菇色素的抗氧化性

2.5.1 羥自由基(·OH)的清除

由圖10可知，紅菇色素對(duì)羥自由基有較強(qiáng)的清除作用，清除率隨著色素濃度的提高而增大。當(dāng)紅菇色素溶液濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)其清除率為43.2%，而當(dāng)其濃度為0.3 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)68.5%，表明了紅菇色素表現(xiàn)出了較好的清除羥自由基的效果。

圖10 紅菇色素對(duì)羥自由基清除作用Fig.10 Scavenging effects of Russula pigment on hydroxy radical

2.5.2 超氧陰離子自由基(O2-·)的清除

由圖11可知，紅菇色素對(duì)鄰苯三酚自氧化具有較強(qiáng)的抑制作用，超氧陰離子自由基清除率隨色素濃度的增加而升高，但當(dāng)濃度增大到一定值時(shí)，清除率的變化幅度會(huì)變小。紅菇色素在此體系表現(xiàn)出很好的清除超氧陰離子自由基的作用，當(dāng)其濃度為0.1 mg/mL時(shí)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)82.3%。

圖11 紅菇色素對(duì)超氧陰離子自由基清除作用Fig.11 Scavenging effects of Russula pigment on superoxide anion radical

2.5.3 DPPH·的清除

由圖12可知，紅菇色素溶液具有一定的清除DPPH自由基的能力，清除率隨濃度的增大而增大，當(dāng)紅菇色素溶液濃度0.02 mg/mL時(shí)，清除率就達(dá)13.3%，而當(dāng)紅菇色素濃度達(dá)到0.1 mg/mL時(shí)，清除率就達(dá)43.2%，說明紅菇色素能有效的清除DPPH自由基。

圖12 紅菇色素對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.12 Scavenging effects of Russula pigment on DPPH radical

4 結(jié)論

(1)紅菇色素為淺紅色，溶于酸性乙醇，最大吸收波長(zhǎng)為201 nm。根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝條件:料液比1∶40(g∶mL)，超聲時(shí)間60 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，超聲功率550 W。

(2)紅菇色素光穩(wěn)定性較差，60℃以下比較穩(wěn)定;葡萄糖對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響較小，而隨著濃度的增加，檸檬酸對(duì)紅菇色素穩(wěn)定性的影響明顯增大，說明檸檬酸對(duì)色素的減色作用明顯;不同濃度的金屬離子對(duì)色素穩(wěn)定性有顯著影響。

(3)紅菇色素對(duì)羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基均具有良好的清除作用。

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