基于p38MAPK通路探討疏肝健脾方藥含藥血清對(duì)LPS刺激下大鼠Kupffer細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用的機(jī)制

韓莉李媛媛1楊欽河1張玉佩1梁蔭基1李樹(shù)成龔享文王觀龍1張金文1林春梅1金玲王攀攀

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510632)

摘要〔〕目的基于p38MAPK通路探討疏肝健脾方藥含藥血清對(duì)脂多糖(LPS)刺激大鼠Kupffer細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)并鑒定SD大鼠Kupffer細(xì)胞，提取并制備疏肝健脾方藥含藥血清，在LPS刺激大鼠Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)基礎(chǔ)上，對(duì)Kupffer細(xì)胞進(jìn)行疏肝健脾方藥含藥血清、p38MAPK抑制劑藥物干預(yù)，ELISA法檢測(cè)Kupffer細(xì)胞上清液中白介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量的表達(dá)，Western印跡檢測(cè)Kupffer細(xì)胞 TLR4、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表達(dá)。結(jié)果疏肝健脾方藥含藥血清提取量約為每只2～3 ml，大鼠獲得純化并經(jīng)免疫熒光法鑒定Kupffer細(xì)胞(0.5～1.0)×107個(gè),Typan blue染色測(cè)定細(xì)胞活力均在95%以上；LPS組較空白血清組IL-6、TNF-α水平均有顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，各藥物干預(yù)組IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與空白血清組比較，LPS組的p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達(dá)均有顯著升高(P<0.01)；與LPS組比較，SB239063能顯著下調(diào)p38MAPK的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，肝健脾組亦有下調(diào)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)；疏肝健脾組、SB239063組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平均下調(diào)顯著(P<0.01)；TLR4蛋白表達(dá)水平以疏肝健脾組下調(diào)具有顯著性差異(P<0.01)，SB239063組下調(diào)無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論疏肝健脾方藥可能對(duì)LPS刺激大鼠Kupffer細(xì)胞炎癥損傷發(fā)揮保護(hù)作用,而含藥血清可能是其重要作用途徑之一。

關(guān)鍵詞〔〕疏肝健脾方藥；p38MAPK；Kupffer細(xì)胞；炎癥損傷

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R28〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)

通訊作者：楊欽河(1961-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病研究。

1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院

第一作者：韓莉(1963-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合肝病基礎(chǔ)與臨床研究。

Based on p38MAPK pathway investigate the effects of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on LPS-stimulated inflammatory injury in Kupffer cells of rats

HAN Li,LI Yuan-Yuan,YANG Qin-He,etal.

The First Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou 510632,Guangdong,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the protective mechanism of the soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum on the Kupffer cells (KCs) of the inflammatory injured rats based on p38 mitogen activated protein kinases (p38MAPK) pathway.MethodsThirty SD rats were randomly divided into normal control,soothing liver and invigoration spleen recipes treatment(SGJP) and KCs extraction groups.After isolation,cultivating and identifying KCs of SD rats,at the same time,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum was made up.KCs of rats with inflammation under LPS stimulation were interfered by normal serum,soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and p38MAPK inhibitor drug (SB239063) respectively.The expressions of interleukin(IL)-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) levels on KCs supernatant were tested by ELISA,while the expressions of KCs toll-like receptor(TLR)4,p38MAPK and P-P38 mitogen-activated protein kinase (p-p38MAPK) were detected by Western blot.ResultsThe extracting volume of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum of each rats was about 2～3 ml (per rats).Purifying and identifying KCs through immunofluorescence assay,(0.5～1.0)×107 units of KCs were ascertained.Both IL-6 and TNF-α levels in LPS group were significantly elevated more than those of normal serum group(P<0.01).Compared with those of LPS group,IL-6 and TNF-α expression levels of the drug intervention group were significantly decreased (P<0.01).Compared with those of normal serum group,protein expressions of TLR4,p38MAPK,p-p38MAPK in LPS group were significantly increased (P<0.01).Compared with that of LPS group,TLR4 protein expression level in SGJP group had a significant difference (P<0.01).The p-p38MAPK protein expression level of soothing liver and invigorating spleen recipes contained serum and SB239063 groups were significantly down-regulated (P<0.01).ConclusionsSoothing liver and invigorating spleen recipes contained serum might have protective effects on the LPS-stimulated inflammatory injury in KCs of rats and contained serum might be one of important pathways of soothing liver and invigorating spleen recipes treating NASH.

【Key words】Soothing liver and invigorating spleen recipes；p38MAPK pathway；Kupffer cells；Inflammatory injury

研究表明，腸源性毒素通過(guò)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟后，能夠調(diào)控Kupffer細(xì)胞活性和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；同時(shí)，腸道細(xì)菌定性和定量的變化導(dǎo)致腸道通透性增高和腸道內(nèi)毒素易位，也會(huì)解酒精個(gè)生月解方生肝炎誘導(dǎo)肝臟多種炎性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因及細(xì)胞因子的激活〔1，2〕。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜，是腸道細(xì)菌內(nèi)毒素最重要的組成部分，能夠誘導(dǎo)活化肝臟Kupffer細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)某些炎癥通路，觸發(fā)細(xì)胞因子〔腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕的釋放，從而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)〔3,4〕。本課題組前期研究表明，中藥復(fù)方疏肝健脾方藥能夠作用于解酒精生脂肪生肝炎(NASH)大鼠肝細(xì)胞p38MAPK通路，抑制白介素(IL)-1、IL-6、TNF-α發(fā)揮抗炎作用，對(duì)解酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝臟p38MAPK蛋白表達(dá)也有明顯抑制作用〔5，6〕。本研究在建立LPS刺激下大鼠Kupffer 細(xì)胞炎癥損傷細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，觀察疏肝健脾方藥含藥血清通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路對(duì)LPS刺激下大鼠Kupffer 細(xì)胞炎癥損傷體外模型的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1藥物疏肝健脾方藥為柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散的合方，柴胡疏肝散：柴胡6 g，白芍5 g，枳殼5 g，川芎5 g，陳皮6 g，香附5 g，炙甘草3 g。參苓白術(shù)散：人參15 g，茯苓15 g，白術(shù)15 g，白扁豆12 g，蓮子9 g，山藥15 g，砂仁6 g，薏苡仁9 g，桔梗6 g，炙甘草9 g。以上藥物均為深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供的中藥配方顆粒劑，購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。

1.2動(dòng)物及分組SPF級(jí)SD大鼠30只，體重(200±20)g，雌雄各半，暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2012-0117。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、疏肝健脾方藥組，Kupffer細(xì)胞提取組。3組，每組10只，正常組給予等體積生理鹽水，疏肝健脾方藥組根據(jù)李儀奎等〔7〕提出的制備含藥血清的給藥方法，給藥劑量=在體實(shí)驗(yàn)的給藥劑量×反應(yīng)系統(tǒng)中被稀釋的倍數(shù)，在體實(shí)驗(yàn)的給藥劑量根據(jù)本課題組前期的研究結(jié)果定為11.9 g/kg〔8〕。因在下一步的細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)中將加入20%的血清，疏肝健脾含藥血清組劑量為59.5 g/kg。

1.3試劑與儀器Ⅳ型膠原酶(美國(guó)Gbico公司)；胎牛血清(德國(guó)Hyclone公司)；兔多克隆抗CK18、ED1、山羊抗兔IgG(H+L),FITC conjugated(鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司)；LPS、SB239063(美國(guó)Sigma公司)；IL-6、TNF-α雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)試劑盒(上海依科賽生物制品有限公司)；抗p38 MAPK、抗磷酸化(P)p38MAPK(美國(guó)CST公司)；抗TLR4(英國(guó)Abcam公司)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；Mini-sub CELLgT電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.4含藥血清的制備SD大鼠均飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，給藥前常規(guī)喂養(yǎng)7 d。第8天起開(kāi)始灌胃給藥，每天2次，12 h一次，連續(xù)3 d。腹主動(dòng)脈采血，分離血清，并進(jìn)行熱滅活處理。最后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Kupffer細(xì)胞提取采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶消化后提取Kupffer細(xì)胞，具體方法參照本課題組論文〔9〕，分離后所獲Kupffer細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6LPS刺激肝細(xì)胞炎癥損傷及藥物干預(yù)用LPS(40 mg/L)刺激在體外培養(yǎng)的Kupffer細(xì)胞，并分別用p38MAPK信號(hào)通路阻斷劑SB239063(2 mg/L)、20%疏肝健脾含藥血清予以干預(yù)，用20%空白血清(空白血清組)作為對(duì)照。

1.7指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1Kupffer細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)及鑒定Typan blue染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察各組細(xì)胞狀態(tài)，通過(guò)免疫熒光對(duì)Kupffer細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.7.2ELISA法檢測(cè)Kupffer細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α含量當(dāng)大鼠Kupffer細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上貼壁生長(zhǎng)、狀態(tài)良好、每孔細(xì)胞數(shù)量不少于1×104個(gè)時(shí)，加入不含血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后再按各組藥物干預(yù)方案添加藥物至目標(biāo)濃度后，放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取細(xì)胞上清，保存?zhèn)溆?。用ELISA方法檢測(cè)Kupffer細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6 的質(zhì)量濃度，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7.3Western印跡法檢測(cè)大鼠Kupffer細(xì)胞p38MAPK相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol/L。按照(5～10)×106個(gè)Kupffer細(xì)胞加入1 ml RIPA裂解液,4℃，10 000～14 000 r/min離心5～10 min，吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。根據(jù)碧云天BCA蛋白濃度試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。Kupffer細(xì)胞樣本進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、4℃過(guò)夜。洗滌后加入二抗，孵育，充分洗滌，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。曝光、 顯影、 定影,最后對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析 。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞數(shù)量每只大鼠可獲得純化后的肝Kupffer細(xì)胞數(shù)量為(0.5～1.0)×107個(gè)，細(xì)胞活力均在95%以上。

2.2細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光鑒定剛提取出的Kupffer細(xì)胞呈圓點(diǎn)形狀,一般15 min左右開(kāi)始貼壁，3 h后基本完全貼壁，細(xì)胞呈梭形，部分有偽足。ED1免疫熒光鑒定，可見(jiàn)梭形的Kupffer細(xì)胞呈綠色熒光，即Kupffer細(xì)胞呈ED1陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1。

Kupffer細(xì)胞

Kupffer細(xì)胞免疫熒光鑒定

2.3Kupffer細(xì)胞狀態(tài)空白血清組Kupffer細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，少見(jiàn)細(xì)胞脫落，細(xì)胞多有偽足，呈健康的梭形細(xì)胞形態(tài)。LPS組可見(jiàn)大量細(xì)胞脫落或細(xì)胞攣縮成小圓點(diǎn)，貼壁細(xì)胞極少，細(xì)胞核不可見(jiàn)，偽足基本全部消失。見(jiàn)圖2。

2.4ELISA法檢測(cè)Kupffer細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α含量與空白血清組比較，LPS組中IL-6、TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)。與LPS組比較，各藥物干預(yù)組IL-6、TNF-α水平均顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.5Western印跡法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞p38MAPK相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平與空白血清組比較，LPS組p38MAPK、p-p38MAPK、TLR4蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與LPS組比較，SB239063組均能顯著下調(diào)上述蛋白表達(dá)水平(P<0.01)；疏肝健脾組亦能下調(diào)p38MAPK的蛋白表達(dá)水平，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，疏肝健脾組、SB239063組p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平均下調(diào)顯著(P<0.01)，TLR4蛋白表達(dá)水平以疏肝健脾組下調(diào)最顯著(P<0.01)；SB239063組亦能下調(diào)TLR4蛋白表達(dá)水平，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表2，圖2。

表1　大鼠Kupffer細(xì)胞IL-6、TNF-α表達(dá)

與空白血清組比較：1)P<0.05；與LPS組比較：2)P<0.01

表2　大鼠肝細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)

與空白血清組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與LPS組比較：3)P<0.01

圖2　Kupffer細(xì)胞p38MAPK、 p-p38MAPK、TLR4蛋白灰度值比較

3討論

Kupffer細(xì)胞被認(rèn)為是腸-肝軸的第一道反應(yīng)程序，體內(nèi)研究表明，腸源性?xún)?nèi)毒素LPS能夠通過(guò)刺激肝Kupffer細(xì)胞導(dǎo)致IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致肝組織損傷，加重NASH的發(fā)展演變〔10,11〕。本次體外研究表明LPS能夠刺激Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6炎癥介質(zhì)，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。這種體內(nèi)外研究的一致性，為NASH發(fā)病機(jī)制體外研究提供了基礎(chǔ)。

LPS刺激Kupffer細(xì)胞導(dǎo)致炎癥介質(zhì)釋放增加，在單純脂肪性肝病變向NASH的發(fā)展演變發(fā)揮了重要作用。TLR4是p38MAPK的上游通路，LPS是TLR4的最重要的配體，由LPS與TLR4相結(jié)合，通過(guò)系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，啟動(dòng)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路。在通過(guò)MYD88依賴(lài)反應(yīng)通路，激活TRAF-6，并與接頭蛋白TAB-1相結(jié)合，再激活TAK-1。TAK-1是TLRS通路和MAPKS的連接紐帶。因此，TLR4最終激活p38MAPK的活化，同時(shí)p38MAPK的活化又與IL-6、TNF-α、IL-10等炎癥因子的表達(dá)密切相關(guān)〔12～14〕。本研究表明，LPS組中LPS刺激Kupffer細(xì)胞TLR蛋白表達(dá)明顯增加，激活導(dǎo)致p38MAPK蛋白表達(dá)及磷酸化。提示p38MAPK信號(hào)通路可能是LPS刺激Kupffer細(xì)胞IL-6、TNF-α炎癥介質(zhì)表達(dá)明顯增加重要通路。

疏肝健脾方是古代名方柴胡疏肝散和參苓白術(shù)散組合方而成，二者主要活性成分包括阿魏酸、人參皂苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、新橙皮苷、芍藥內(nèi)酯苷和白術(shù)苷等。其中柚皮苷、橙皮苷和阿魏酸等活性成分被證實(shí)具有一定的抗炎作用。前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，疏肝健脾方藥具有通過(guò)調(diào)控Kupffer細(xì)胞，使p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，最終達(dá)到減輕炎癥損傷的效果〔5，6〕。將含藥血清用于體外細(xì)胞培養(yǎng)是中藥復(fù)方研究的重要方向，藥物將受試藥物經(jīng)口給予動(dòng)物后，取其血清作為藥物源加入離體反應(yīng)系統(tǒng)中研究其藥理作用，比較接近藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，其原有成分或在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性成分，或代謝后失活，或沒(méi)有被吸收入體內(nèi)，或通過(guò)第二信使而間接起作用都可以通過(guò)血清藥理學(xué)反映出來(lái)，理論上更具備科學(xué)性、真實(shí)性〔15〕。本次研究應(yīng)用從SD大鼠中提取并制備的疏肝健脾方藥含藥血清，并將含藥血清對(duì)LPS刺激大鼠體外Kupffer細(xì)胞造成的炎癥損傷進(jìn)行干預(yù)結(jié)果提示含藥血清調(diào)控Kupffer細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，這與體內(nèi)試驗(yàn)的研究結(jié)果具有一致性。藥物吸收入血可能是疏肝健脾方藥作用于Kupffer細(xì)胞p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及活化，減少炎癥介質(zhì)(IL-6、TNF-α)的釋放，最終達(dá)到減輕炎癥損傷的重要作用途徑。有研究表明〔16,17〕參苓白術(shù)散及柴胡疏肝散具有調(diào)節(jié)腸道菌群失衡及殺菌抗炎的效果，而LPS作為是細(xì)菌內(nèi)毒素最重要的組成部分，在NASH的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。疏肝健脾方藥是否能夠通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境而減少內(nèi)毒素LPS產(chǎn)生有待進(jìn)一步研究。

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〔2014-05-17修回〕

(編輯李相軍)