楊桂紅，黃一帆，林珊珊，祁保民，王全溪

(中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

神經(jīng)肽S(neuropeptide S，NPS)是在2002年通過(guò)反向藥理學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種具有多種生物活性的神經(jīng)肽，后被鑒定為孤兒受體GPR154(又稱(chēng)GPRA、VRR1)的內(nèi)源性配體[1]，共有20個(gè)氨基酸[2].因NPS氨基端的氨基酸殘基均為絲氨酸(serine，縮寫(xiě)為S)，因此有研究者將其命名為Neuropeptide S(NPS)[3].NPS通過(guò)其受體 GPR154(neuropeptide receptor，NPSR)發(fā)揮作用[4－5].NPSR 有兩種，即 NPSR-A 和 NPSR-B，均屬于G蛋白藕聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)，主要為Gs和Gq蛋白.NPS和NPSR在動(dòng)物體內(nèi)的分布及其廣泛，二者構(gòu)成了NPS—NPSR系統(tǒng)[6]，參與介導(dǎo)多種生理功能，如喚醒、抑制各期睡眠、抑制攝食、免疫調(diào)節(jié)和影響神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)等[7－13].上述的研究報(bào)道僅集中在人、豬、兔和鼠等動(dòng)物，而關(guān)于禽類(lèi)NPS的基因序列及NPS對(duì)禽類(lèi)的功能作用如何則尚未見(jiàn)報(bào)道.番鴨是閩臺(tái)地區(qū)的特色水禽動(dòng)物，研究NPS對(duì)番鴨免疫功能的影響，對(duì)閩臺(tái)地區(qū)的水禽養(yǎng)殖業(yè)具有重要的指導(dǎo)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.本試驗(yàn)在首次克隆番鴨NPS基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究NPS對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，旨在為深入探討其對(duì)鴨的免疫調(diào)節(jié)作用以及作為免疫增強(qiáng)劑的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 12－13日齡番鴨購(gòu)于福建省莆田市克里莫種鴨場(chǎng).

1.1.2 試劑 Trizol RNA提取試劑盒、Taq酶、dNTP、DNA Marker(DL2000)購(gòu)自大連 TaKaRa公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Promega公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司，用pH為7.4的PBS緩沖液配成含量為5 mg·mL－1的溶液，經(jīng)0.22 μm的微孔濾器過(guò)濾，避光保存;裂解液、二甲基亞砜(DMSO，分析純)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖購(gòu)自上海生物工程公司.

RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;番鴨NPS購(gòu)自康肽生物科技(北京)有限公司，臨用前濃度分別配成 0.01、0.1、1、10、100 和1000 nmol·L－1;細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)購(gòu)自 Sigma 公司，臨用前含量配成20 ng·mL－1;植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，臨用前含量配成80 ng·mL－1;淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海恒信化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.1.3 儀器 主要儀器有超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái))、CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Revco公司)、Model 680型酶標(biāo)儀(美國(guó)Beckman公司)、XSZ-D2型倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠(chǎng))、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó)Costar公司)、高壓滅菌鍋(ZDX-35BI型座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器).

1.2 基因克隆

1.2.1 總RNA的提取 番鴨經(jīng)正常放血處死，無(wú)菌條件下取出脾臟，按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作并提取樣品組織中的總RNA，同時(shí)采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA電泳條帶的清晰度和完整性，各泳道點(diǎn)樣孔沒(méi)有殘留，條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，表明RNA無(wú)降解，質(zhì)量可靠.

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增 以提取的RNA為模板，按M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA.RT反應(yīng)體系為 25 μL，含 2 μg 總 RNA、2 μL 0.4 pmol·L－1Oligo dT 引物、2 μL 0.4 mmol·L－1dNTP、4 μL DEPC處理水，于70℃變性5 min后立即放冰上冷卻，再加入0.2 μL 8 U RNA酶抑制劑、0.5 μL 100 U M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、5 μL 5 × RT buffer、9.3 μL DEPC 處理水，于37 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃反應(yīng)5 min.同時(shí)，用不加反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄體系作為陰性對(duì)照，用于檢測(cè)總RNA樣品中是否有基因組DNA污染.反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RT產(chǎn)物)分裝后置－20℃保存?zhèn)溆?

1.2.3 克隆引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 參照GenBank中已有的近緣物種NPS基因cDNA序列，分析NPS基因的保守序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)NPS基因克隆引物，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)條件和循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳反應(yīng)條件.PCR 反應(yīng)體系為25 μL，含2 μL 模板(RT 產(chǎn)物)，2.5 μL 10 ×PCR buffer[含50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 9.0)、100 mmol·L－1NaCl、100 mmol·L－1DTT、0.1 mmol·L－1EDTA、50% 甘油、0.3%Triton-X-100]，2 μL 2.5 mmol·L－1dNTPs，1.5 μL 鎂離子，20 pmol·L－1上、下游引物各 1 μL，1.0 U Taq DNA聚合酶，加滅菌ddH2O補(bǔ)足.反應(yīng)條件如下.(1)變性:94℃ 5 min;(2)復(fù)性:94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);(3)延伸:72℃ 10 min.同時(shí)用滅菌的ddH2O和RNA樣品分別取代RT產(chǎn)物作對(duì)照，以檢驗(yàn)是否有外源和基因組DNA污染.擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳.用DNA片段膠回收試劑盒回收特異性條帶.

1.2.4 克隆和序列測(cè)定 將回收產(chǎn)物連接到pMD-18T載體上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，最后用菌液PCR鑒定.挑選陽(yáng)性克隆的菌液送交測(cè)序，序列測(cè)定由上海英駿公司完成.

1.2.5 序列分析 運(yùn)用DNA Star和Clustalx軟件將克隆所得序列與GenBank上已發(fā)表的NPS基因序列進(jìn)行比對(duì)和分析.通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心BLASP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blasp)氨基酸序列分析NPS和其他物種的同源性.用綜合指數(shù)的最大似然法計(jì)算進(jìn)化距離和每個(gè)位點(diǎn)堿基替換的數(shù)量和單位，采用CLUSTAL W算法，用MEGA 4.0軟件中的鄰接法推斷進(jìn)化樹(shù).

1.3 番鴨脾臟的采集及其淋巴細(xì)胞的分離

番鴨經(jīng)正常放血處死，無(wú)菌條件下取出脾臟，用PBS或無(wú)菌生理鹽水沖洗3次，剪去被膜.置脾臟于研磨器中輕輕研碎，加40－60 mL Hanks液，用吸管反復(fù)吹打研碎組織，經(jīng)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，加入淋巴細(xì)胞分離液，于2000 r·min－1離心20 min，吸取中間云霧狀的白細(xì)胞層，用Hanks液洗2次，用RPMI 1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成1×107個(gè)·mL－1的細(xì)胞懸液.臺(tái)盼蘭染色測(cè)定活細(xì)胞率大于95%，備用.

1.4 NPS對(duì)細(xì)胞增殖影響的測(cè)定

采用MTT法[14]測(cè)定NPS對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的影響.分離培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)20 ng·mL－1LPS 或 80 ng·mL－1PHA 的預(yù)處理后，再分別加入0.01、0.1、1、10、100 和 1000 nmol·L－1NPS 共同孵育，同時(shí)設(shè)置20 ng·mL－1LPS、80 ng·mL－1PHA、各濃度NPS和空白對(duì)照等作為對(duì)照組.試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，每個(gè)組別重復(fù)6孔.加樣后將96孔培養(yǎng)板置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.終止培養(yǎng)前4 h置于超凈工作臺(tái)上，每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出.各孔吸棄上清液，加入100 μL裂解液，室溫放置20 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的光密度(D)，作為脾淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo).

表1 NPS、PHA和LPS在脾淋巴細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)的用量Table 1 The design of NPS and PHA/LPS used in proliferation experiment in vitro

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件處理，結(jié)果采用多重比較、F-檢驗(yàn)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 番鴨NPS基因的克隆

基因測(cè)序結(jié)果表明:本試驗(yàn)所克隆的番鴨NPS基因?yàn)?81 bp的目的片段(圖1);核苷酸的同源性分析顯示，番鴨NPS基因與人、小鼠、大鼠、豬和兔等物種NPS基因的同源性分別為 74.6%、72.9%、74%、77.3% 和76.8%.番鴨NPS基因包含177個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼59個(gè)氨基酸殘基(圖2)，并在N末端包含7個(gè)氨基酸殘基(SFRNGVG)(圖3A)，總分子質(zhì)量為6.57981 ku.系統(tǒng)發(fā)育分析表明，番鴨NPS氨基酸序列與其他已知物種NPS氨基酸序列的同源性都很高，氨基酸的差異很小，尤其與雞的同源性最高，僅在N末端出現(xiàn)一個(gè)氨基酸的差異(圖3B).

2.2 NPS對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.2.1 NPS單獨(dú)處理對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 圖4(A)顯示，與對(duì)照組相比，0.01－1000 nmol·L－1NPS可促進(jìn)番鴨脾淋巴細(xì)胞在體外的增殖.其中，1、100和1000 nmol·L－1NPS顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖(P＜0.05);10 nmol·L－1NPS極顯著促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖(P ＜0.01);而 0.01 和0.1 nmol·L－1NPS 對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖效果不顯著(P ＞0.05).有趣的是，只有10 nmol·L－1NPS對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖有極顯著作用，但當(dāng)其濃度上升到100或1000 nmol·L－1時(shí)，NPS對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖效果逐漸降低.

圖1 番鴨NPS基因的RT-PCR結(jié)果Fig.1 RT-PCR results of moscovy duck NPS gene

圖2 番鴨NPS前體基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and the deduced amino acid residues of moscovy duck pre-NPS mRNA

圖3 番鴨NPS序列的比較Fig.3 Sequence comparison and analysis of moscovy NPS

圖4 不同濃度NPS對(duì)經(jīng)LPS或PHA預(yù)處理的番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of NPS treatment on proliferation of moscovy duck splenic lymphocytes

2.2.2 NPS對(duì)經(jīng)LPS預(yù)處理的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 圖4(B)顯示，所有NPS+LPS組的D570nm明顯高于NPS組.NPS對(duì)經(jīng)LPS預(yù)處理的番鴨脾淋巴細(xì)胞的增殖能力隨著NPS濃度的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)NPS濃度升高到100 －1000 nmol·L－1時(shí)，這種增強(qiáng)的趨勢(shì)急劇下降;當(dāng)NPS 濃度為0.1 －10 nmol·L－1時(shí)，NPS+LPS組的D570nm極顯著高于LPS組(P＜0.01).當(dāng)NPS濃度為10 nmol·L－1時(shí)，NPS對(duì)經(jīng) LPS預(yù)處理的脾淋巴細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng);然而，當(dāng)NPS濃度為0.1 nmol·L－1時(shí)，NPS+LPS組的D570nm與LPS組的差異不顯著(P＞0.05);當(dāng)NPS濃度為0.01 nmol·L－1時(shí)，NPS+LPS組對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力極顯著低于LPS 組(P ＜0.01).

2.2.3 NPS對(duì)經(jīng)PHA預(yù)處理的脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 圖4(C)顯示，所有NPS+PHA組的D570nm明顯高于NPS組(P＜0.05).當(dāng)NPS濃度為100和1000 nmol·L－1時(shí)，NPS+PHA組的D570nm極顯著低于PHA組(P＜0.01);當(dāng)NPS濃度為1 nmol·L－1時(shí)，NPS對(duì)經(jīng)PHA預(yù)處理的番鴨脾淋巴細(xì)胞的增殖能力最強(qiáng);當(dāng)NPS濃度為0.1和10 nmol·L－1時(shí)，NPS+PHA組對(duì)脾淋巴細(xì)胞的增殖能力與PHA組的差異不顯著(P＞0.05).

2.2.4 NPS與LPS或PHA協(xié)同作用對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 圖5顯示，所有NPS+LPS組的D570nm及NPS+PHA組的D570nm均明顯高于同一濃度下NPS組.表明0.01－1000 nmol·L－1NPS與LPS或PHA對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞的增殖均具有協(xié)同作用.

圖5 不同濃度的NPS與LPS或PHA協(xié)同作用對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of different dose of NPS and its cooperation with LPS and PHA on proliferation of moscovy duck splenic lymphocytes

3 討論

研究表明，NPS在動(dòng)物免疫器官中的分布及其介導(dǎo)參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能為NPS可參與動(dòng)物機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用提供了有利的證據(jù).然而，上述的研究對(duì)象都側(cè)重于人和豬[15].關(guān)于NPS是否參與禽類(lèi)的免疫調(diào)節(jié)作用仍然不清楚.因此，本試驗(yàn)首先克隆了番鴨的NPS基因，并通過(guò)體外試驗(yàn)初步探討NPS對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞增殖的效果，為深入探討NPS參與禽類(lèi)免疫功能方面的調(diào)節(jié)提供了初步依據(jù).

關(guān)于NPS氨基酸序列結(jié)構(gòu)和活性的研究表明，所有物種NPS的前體基因似乎是相同的，只有少數(shù)位于肽中心、羧基末端和N末端部分顯示序列變異，尤其Phe2－ARG3－Asn4是受體結(jié)合和生物活性至關(guān)重要的位點(diǎn)[16－18].本試驗(yàn)結(jié)果表明，番鴨NPS氨基酸序列與已知物種NPS氨基酸序列具有高度的保守性，而且其氨基酸序列也包含了在其他物種NPS中同樣保守的7個(gè)氨基酸殘基(SFRNGVG).番鴨NPS同樣具有完全保守的7個(gè)氨基酸殘基進(jìn)一步反映了其為結(jié)合受體所必需的活性結(jié)構(gòu)[2].番鴨NPS高度保守性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)豐富了原先僅四足脊椎動(dòng)物NPS保守性的特點(diǎn).因此，確定番鴨NPS的氨基酸序列，為研究其生物學(xué)功能提供了依據(jù).

NPS廣泛分布于豬體內(nèi)[15]，關(guān)于NPS在番鴨體內(nèi)的分布尚未見(jiàn)報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)室成員在研究中發(fā)現(xiàn)，NPS陽(yáng)性細(xì)胞在鴨脾臟和法氏囊均有分布，這為其參與禽類(lèi)的免疫調(diào)節(jié)提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ).特別是NPS的陽(yáng)性細(xì)胞主要位于番鴨脾臟的淺層皮質(zhì)區(qū)，表明NPS可對(duì)脾淋巴細(xì)胞發(fā)揮直接作用.Yao et al[19]對(duì)人源 NPS 調(diào)節(jié)豬脾淋巴細(xì)胞增殖能力的研究表明，1 nmol·L－1NPS、0.01 nmol·L－1NPS+LPS 和 1 nmol·L－1NPS+PHA均能促進(jìn)豬脾淋巴細(xì)胞的增殖;而本試驗(yàn)結(jié)果表明，10 nmol·L－1NPS、10 nmol·L－1NPS+LPS、1 nmol·L－1NPS+PHA均可顯著促進(jìn)番鴨脾淋巴細(xì)胞的增殖.本試驗(yàn)結(jié)果與Yao et al[19]的研究結(jié)果相比，在增殖效應(yīng)上相似，但存在著與NPS工作濃度有關(guān)的差異.導(dǎo)致這種差異的原因可能有以下幾個(gè)方面:首先，所使用的肽源及試驗(yàn)動(dòng)物之間的種屬差異不同，本試驗(yàn)中，番鴨NPS與試驗(yàn)動(dòng)物番鴨之間的親緣性大于Yao et al[19]采用的人源NPS與試驗(yàn)動(dòng)物豬的親緣性;其次，分離自不同物種的脾淋巴細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致不同的細(xì)胞增殖能力;第三，在動(dòng)物個(gè)體不同的生長(zhǎng)階段分離培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)特性也是不同的.然而，應(yīng)該指出的是，統(tǒng)計(jì)學(xué)上的效果顯著是神經(jīng)肽在納摩爾范圍內(nèi)引起的，這是根據(jù)NPS在體外的大部分研究得出的[6].總之，雖然體外試驗(yàn)的結(jié)果不能完全反映體內(nèi)的情況，但本試驗(yàn)的結(jié)果至少表明NPS可能參與番鴨體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，為其參與免疫功能方面的調(diào)節(jié)提供了分子生物學(xué)和免疫學(xué)方面的依據(jù).

本試驗(yàn)所克隆的番鴨NPS核苷酸序列和氨基酸序列與已知親緣物種NPS的相應(yīng)序列之間存在極高的同源性，尤其與雞的親緣關(guān)系最近.0.01－1000 nmol·L－1NPS均能促進(jìn)番鴨脾淋巴細(xì)胞的體外增殖，其中以10 nmol·L－1NPS的增殖效果最好;10 nmol·L－1NPS協(xié)同LPS及1 nmol·L－1NPS協(xié)同PHA對(duì)番鴨脾淋巴細(xì)胞的增殖效果分別高于各自的對(duì)照組.

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