吳華俊，許 雯，林 同

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，廣東廣州510642)

松墨天牛(Monochamus alternatus Hope)又名松褐天牛，松天牛，屬于鞘翅目(Goleoptera)，天?？?Cerambycidae)，是重要的針葉樹害蟲，主要危害馬尾松、油松、黑松等樹干和枝條的韌皮部和木質(zhì)部，嚴(yán)重影響松樹的生長.同時，也是松材線蟲萎蔫病(Bursaphelenchus xylophilus)的主要傳播媒介，此病是松樹的毀滅性病害，已經(jīng)對我國松樹森林資源造成嚴(yán)重危害[1－2].

肌鈣蛋白(Troponin，Tn)是與骨骼肌和心肌收縮有關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，主要調(diào)節(jié)肌肉的收縮和舒張.肌鈣蛋白是橫紋肌的結(jié)構(gòu)蛋白，存在于肌原纖維的細(xì)絲中，由3個結(jié)構(gòu)不同亞基——肌鈣蛋白I(TnI)、肌鈣蛋白T(TnT)和肌鈣蛋白C(TnC)組成[3－4].TnT分子質(zhì)量為37 ku，可能為不對稱蛋白結(jié)構(gòu)，是原肌球蛋白的結(jié)合亞基[5].

由于昆蟲飛行肌以很高的收縮頻率運(yùn)行，肌鈣蛋白的激發(fā)和松弛的調(diào)節(jié)就發(fā)揮尤其重要的作用.TnT轉(zhuǎn)錄本與收縮性能聯(lián)系緊密.Marden et al[6]研究表明，TnT轉(zhuǎn)錄本混合物與梅利蜻蜓(Libellula pulchella)自由飛行中的翅膀震動頻率有很大的相關(guān)性.本研究從已經(jīng)構(gòu)建好的松墨天牛cDNA文庫中篩選到TnT基因的部分cDNA序列，通過cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)得到了該基因的cDNA全長序列，以期為闡明松墨天牛肌肉生理學(xué)和運(yùn)動性能提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

松墨天牛幼蟲由廣東省林科院惠贈(采自廣州市蘿崗區(qū)馬尾松次生林).用人工飼料在25℃、相對濕度70% －75%、黑暗條件下飼養(yǎng)至成蟲[7].

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取松墨天?？俁NA.總RNA經(jīng)純化后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，并用微量紫外分光光度儀(Nanodrop 2000)檢測其純度并定量，置于－80℃保存?zhèn)溆?反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser說明書進(jìn)行，獲得第一鏈cDNA，用于3'RACE，置于－20℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 引物設(shè)計和3'RACE擴(kuò)增 根據(jù)已構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫[8]，獲得了肌鈣蛋白的5'端序列(GenBank:JZ144485).本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)行3'RACE擴(kuò)增，以獲得肌鈣蛋白基因全序列.用DNAStar中的Primer select軟件設(shè)計特異性引物(Troponin Outer:AGAGGAGGAGGAAGAAGAGGAGAT;Troponin Inner:CAACGCGCAAAGGAAGAGGAAGAC)，結(jié)合試劑盒提供的2個下游引物3'RACE outer Primer(TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT)和 3'RACE inner Primer(CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG)進(jìn)行巢式PCR.首先用通用引物3'RACE Outer Primer和特異性引物Troponin Outer進(jìn)行第1次Outer PCR擴(kuò)增，具體的PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min，94℃解鏈30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，20個循環(huán)，72℃延伸10 min.反應(yīng)完畢后取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物，使用通用引物3'RACE Inner PCR和特異性引物Troponin Inner進(jìn)行巢式PCR的Inner PCR擴(kuò)增.反應(yīng)進(jìn)行30個循環(huán)，其它條件同第1次Outer PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物經(jīng)由2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的DNA片段，與PUCm-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行AMP抗性藍(lán)白斑篩選，挑陽性菌落提取質(zhì)粒.經(jīng)PCR鑒定后測序.

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 基因及蛋白質(zhì)特性分析 用 NCBI在線工具 ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nib.gov/gorf/grof.html)搜索開放閱讀框，TMHMM分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域，NetPhos(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)預(yù)測磷酸化修飾位點(diǎn)，丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器上的SignalP 4.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽，NetOGlye軟件分析糖基化修飾，ProtScale程序分析疏水性，COILS Server(http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html)預(yù)測卷曲螺旋，SABLE 軟件(http://sable.cchmc.org/)分析二級結(jié)構(gòu)，由視圖工具POLYVI-EW將預(yù)測結(jié)果轉(zhuǎn)化為圖形形式輸出.

1.3.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 通過 NCBI(http://www.Ncbi.nlm.Nih.gov/)GenBank數(shù)據(jù)庫檢索昆蟲肌鈣蛋白氨基酸序列，用DNAMAN軟件對松墨天牛肌鈣蛋白及其他昆蟲肌鈣蛋白進(jìn)行同源性比對;用Clustal X軟件和MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ法).

1.4 RT-qPCR 檢測

以肌鈣蛋白基因在成蟲的表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)參量，以微管蛋白(β-actin)基因?yàn)閮?nèi)參基因，無菌超純水為陰性對照，采用RT-qPCR(SYBR Green)檢測肌鈣蛋白基因在幼蟲、蛹、成蟲各部位的表達(dá)量.所用引物為:上游:CGATGAGGAAAGGAAGATGG;下游:AAGTTGGGGCCTTTGTTCTT.RT-qPCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃解鏈10 s，60℃延伸20 s，進(jìn)行40個循環(huán).反應(yīng)在LightCycler 480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，設(shè)cDNA樣品3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后采集目標(biāo)基因的Ct值和2個內(nèi)參基因的Ct平均值，利用2－ΔΔCT相對定量法計算相對表達(dá)量.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆

將3'RACE測序結(jié)果去除載體序列部分，并與已知序列拼接獲得松墨天牛肌鈣蛋白基因的cDNA，命名為MaTnT(GenBank:KJ756400)，全長為1531 bp，開放閱讀框(ORF)為1020 bp，編碼339個氨基酸(圖1)，推測的編碼蛋白等電點(diǎn)為9.26，分子質(zhì)量為37.29 ku.

圖1 MaTnT基因全長及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MaTnT

2.2 同源性比對及進(jìn)化樹構(gòu)建

用DNAMAN軟件做出MaTnT與嗜鳳梨果蠅(Drosophila ananassae)、果蠅(Drosophila grimshawi)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、印田鱉蝽(Lethocerus indicus)、華尺蠖(Biston betularia)、家蠶(Bombyx mori)、家白蟻(Coptotermes formosanus)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)、柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)、野桑蠶(Bombyx mandarina)、大紅班蝶(Danaus plexippus)和點(diǎn)蜂緣蝽(Riptortus pedestris)等12種昆蟲的Tn氨基酸序列同源性比對(圖2).MaTnT與圖2中12種昆蟲Tn同源性為87% －88%，其中與褐飛虱、黑腹果蠅、野桑蠶等10種昆蟲的同源性為88%;與家白蟻、大紅斑蝶的同源性為87%.

由MEGA 4.0軟件構(gòu)建的基于這12種昆蟲Tn的系統(tǒng)發(fā)育樹表明:松墨天牛是一個獨(dú)立的分支，與家蠶(Bombyx mori)、果蠅(Drosophila grimshawi)等8種昆蟲遺傳距離相對較近;而與家白蟻、褐飛虱、印田鱉蝽(Lethocerus indicus)、華尺蠖等(Biston betularia)4種昆蟲遺傳距離相對較遠(yuǎn)(圖3).由于松墨天牛是鞘翅目昆蟲，其他昆蟲都不屬于鞘翅目，這一結(jié)果與這些昆蟲的傳統(tǒng)分類地位是一致的.

2.3 跨膜結(jié)構(gòu)域及翻譯后修飾分析

通過MaTnT的磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Tn分值＞0.5的磷酸化位點(diǎn)有:絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)8個，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)9個，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)3個，共計20個磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)相對均勻地分布在整個多肽鏈中(圖1).NetOGlye預(yù)測表明，MaTnT在150、161、170氨基酸位點(diǎn)存在N-糖基化修飾.

圖2 MaTnT與其他12種昆蟲Tn氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of MaTnT and Tns from other insects

2.4 MaTnT的二級結(jié)構(gòu)、卷曲螺旋與疏水性分析

MaTnT二級結(jié)構(gòu)為混合型，N末端和C末端區(qū)域都包含了螺旋和不規(guī)則卷曲兩種形式，其中 α-螺旋占 80.53%，卷曲占 19.47%，它們構(gòu)成了MaTnT蛋白的結(jié)構(gòu)元件，無β-轉(zhuǎn)角存在.卷曲螺旋是由2股或以上的α-螺旋相互纏繞形成的超二級結(jié)構(gòu)，是控制蛋白質(zhì)寡聚化的元件，也是一種簡單的三級結(jié)構(gòu).MaTnT一共有14個卷曲螺旋.

在MaTnT 175－200氨基酸位存在一個明顯的疏水性區(qū)域，但整個多肽鏈中大多數(shù)氨基酸的分值較低，親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故MaTnT屬于親水性氨基酸.

2.5 MaTnT 基因的表達(dá)

圖3 基于昆蟲Tn氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of insect based on their amino acid sequences of Tn

利用RT-qPCR分析MaTnT基因在松墨天牛不同發(fā)育階段和成蟲不同部位的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，MaTnT基因在成蟲的表達(dá)量最高，在幼蟲的表達(dá)量最低，蛹和幼蟲的表達(dá)量分別是成蟲的0.95倍和0.33倍，基因表達(dá)在三者之間差異顯著(P＜0.05)(圖4).MaTnT基因在成蟲的頭部、胸部、觸角、腹部、足和觸角中均有表達(dá)且有顯著差異(P＜0.05)，在觸角的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他部位，胸部的表達(dá)量最低(圖5).

圖4 松墨天牛不同蟲態(tài)MaTnT基因表達(dá)量RT-qPCR分析Fig.4 The relative expression level of MaTnT in developmental stages of M.alternatus detected by RT-qPCR

圖5 松墨天牛成蟲不同部位中MaTnT基因表達(dá)量RT-qPCR分析Fig.5 The relative expression level of MaTnT in different parts of M.alternatus adults detected by RT-qPCR

3 討論

Tn基因的數(shù)量和分布在多細(xì)胞生物中是多變的.在哺乳動物中，TnI和TnT分別由3個基因編碼，并且TnT-TnI是成對組裝[9－10]，然而在昆蟲中，TnT基因由單個基因編碼[11－12].目前對昆蟲 TnT基因功能研究的不多，只有梅利蜻蜓(Libellula pulchella)TnT基因研究的報道[6].本研究克隆了松墨天牛肌鈣蛋白基因，在NCBI上的Blast比對結(jié)果表明該基因是TnT基因(MaTnT)，開放閱讀框?yàn)?020 bp，編碼339個氨基酸，推測的分子質(zhì)量為37.29 ku.

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜中蛋白和膜脂結(jié)合的主要部位，它可能定位于膜的錨定蛋白或離子通道蛋白等，也可能作為膜受體起作用.通過跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測可以了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能及在細(xì)胞中的作用部位.利用TMHMM軟件對MaTnT的跨膜結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明:MaTnT的整條肽鏈都位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域.SignalP分析表明，MaTnT不含信號肽，說明該蛋白質(zhì)屬于定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，由于不分泌到胞外，因而不屬于膜蛋白或分泌蛋白，與TMHMM分析結(jié)果一致.跨膜結(jié)構(gòu)主要是以α-螺旋為主，由于MaTnT不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，所以MaTnT的卷曲螺旋可能是其他功能域.

肌鈣蛋白是Ca2+的受體.RNA選擇性剪切產(chǎn)生TnT轉(zhuǎn)錄本的變化，從而引發(fā)梅利蜻蜓飛行肌在亞細(xì)胞和整個肌肉水平上收縮性能的變化[6].TnT的相對豐度與內(nèi)肌肉纖維Ca2+的敏感性(10倍變化范圍)、力量最大值(3倍變化范圍)、最大功率系數(shù)正相關(guān)，也與翅膀震動頻率和振幅正相關(guān).TnT的變化可能會對這些參數(shù)產(chǎn)生影響，或者說TnT是顯示一整套共同調(diào)控分子變化的指標(biāo).單個基因的選擇性剪切可能引起更大范圍內(nèi)在分子、組織和整個機(jī)體水平上收縮性能的改變.TnT選擇性剪切比例的變化可能是肌肉收縮性能變化的機(jī)理，因?yàn)橄喈?dāng)少量轉(zhuǎn)錄本相對豐度的很小變化會引起收縮性能很大的改變[6].現(xiàn)在還不知道MaTnT選擇性剪切是不是導(dǎo)致這些效應(yīng)的唯一分子因素，或者M(jìn)aTnT剪切的變化由一套其它分子因素所調(diào)節(jié).

肌鈣蛋白主要通過TnT結(jié)合于原肌球蛋白上(tropomyosin)[13－14].由于兔子骨骼肌中TnT和原肌球蛋白交互調(diào)節(jié)表達(dá)[15]，因此MaTnT的變化可能伴隨著其它收縮和調(diào)節(jié)蛋白的改變，這些蛋白與MaTnT一起引發(fā)松墨天牛肌肉收縮行為.肌鈣蛋白基因在松墨天牛幼蟲、蛹和成蟲中都有表達(dá)，說明肌鈣蛋白基因在松墨天牛的整個發(fā)育過程中起重要作用;在成蟲觸角中表達(dá)最高，可能與觸角覓食、求偶中發(fā)揮的功能有關(guān);在足中表達(dá)量也較高，這是與足的運(yùn)動功能相適應(yīng)的.

本研究獲得了松墨天牛的1個轉(zhuǎn)錄本，但梅利蜻蜓的飛行肌中含有由單一TnT基因轉(zhuǎn)錄而成的6種選擇性剪切轉(zhuǎn)錄本[6]，由此我們推測松墨天牛肌纖維中也有可能存在多種TnT轉(zhuǎn)錄本，它們與其它調(diào)控因子共同影響肌肉的收縮.但MaTnT有多少轉(zhuǎn)錄本，MaTnT轉(zhuǎn)錄的時空表達(dá)模式如何，以及MaTnT如何與原肌球蛋白互作等需要進(jìn)一步研究.

綜上，昆蟲肌鈣蛋白基因的功能研究較少，很多內(nèi)容具有不確定型，需要深入探討，本文首次克隆了松墨天牛肌鈣蛋白基因，并從生物信息學(xué)角度對基因進(jìn)行了分析，以后的研究可以此為參考，闡明松墨天牛肌肉收縮和行為機(jī)理，以豐富昆蟲肌肉生理學(xué)內(nèi)容.

[1]胡長效，蘇新林，張艷秋.我國松墨天牛研究進(jìn)展[J].河北林果研究，2003，18(3):293－299.

[2]呂傳海，濮厚平，韓兵，等.松墨天牛生物學(xué)特性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)報，2000，27(3):243－246.

[3]FARAH C S，REINACH F C.The troponin complex and regulation of muscle contraction[J].FASEB Journal，1995，9(9):755－767.

[4]CLARK K A，MCELHINNY A S，BECKERLE M C，et al.Striated muscle cytoarchitecture:An intricate web of form and function[J].Annual Review of Cell and Developmental Biology，2002，18:637 －706.

[5]馮品寧，劉敏，崔穎鵬，等.心肌肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I及CK-MB診斷急性心肌梗死臨床應(yīng)用價值的比較分析[J].2008，12(10):1256 －1258.

[6]MARDEN J H，F(xiàn)ITZHUGH G H，GIRGENRATH M，et al.Alternative splicing，muscle contraction and intraspecific variation:Associations between troponin T transcripts，Ca2+sensitivity and the force and power output of dragonfly flight muscles during oscillatory contraction[J].Journal of Experimental Biology，2001，204(20):3457 －3470.

[7]徐金華，黃秀鳳，徐華潮，等.松墨天牛室內(nèi)人工飼養(yǎng)及其生物學(xué)特性觀察[J].浙江林業(yè)科技，2009，29(4):86－88.

[8]WEI C M，LUO L L，WU H J，et al.Oligonucleotide microarray-based gene expression analysis of pine sawyer(Monochamus alternatus)after treatment with a sublethal dose of diflubenzuron[J].Journal of Asia-Pacific Entomology，2013，16(4):489 －495.

[9]BARTON P J R，CULLEN M E，TOWNSEND P J，et al.Close physical linkage of human troponin genes:Organization，sequence，and expression of the locus encoding cardiac troponin I and slow skeletal troponin T[J].Genomics，1999，57:102 －109.

[10]HUANG Q Q，JIN J P.Preserved close linkage between the genes encoding troponin I and troponin T，reflecting an evolution of adapter proteins coupling the Ca(2+)signaling of contractility[J].Journal of Molecular Evolution，1999，49(6):780 －788.

[11]BARBAS J A，GALCERAN J，TORROJA L，et al.Abnormal muscle development in the heldup3 mutant of Drosophila melanogaster is caused by a splicing defect affecting selected troponin I isoforms[J].Molecular and Cellular Biology，1993，13(3):1433－1439.

[12]BENOIST P，MAS JA，MARCO R，et al.Differential muscle-type expression of the Drosophila troponin T gene.A 3-base pair microexon is involved in visceral and adult hypodermic muscle specification[J].Journal of Biological Chemistry，1998，273(13):7538－7546.

[13]FILATOV V L，KATRUKHA A G，BULARGINA T V，et al.Troponin:Structure，properties，and mechanism of functioning[J].Biochemistry(Moscow)1999，64(9):969－985.

[14]GORDON A M，HOMSHER E，REGNIER M.Regulation of contraction in striated muscle[J].Physiological Reviews，2000，80(2):853 －924.

[15]BRIGGS M M，MCGINNIS H D，SCHACHAT F.Transitions from fetal to fast troponin T isoforms are coordinated with changes in tropomyosin and alpha-actinin isoforms in developing rabbit skeletal muscle[J].Developmental Biology，1990，140(2):253－260.