嚴(yán)俊杰，張 云，張 磊，謝 斌，邱慶林，謝寶貴

(福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心福建福州350002)

草菇(Volvariella volvacea)，又稱中國蘑菇，是一種熱帶和亞熱帶栽培食用菌，因其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，具有降膽固醇、降血壓及抗腫瘤等作用，而廣受廣受消費(fèi)者喜愛[1].草菇具有生長速度快、耐高溫、栽培周期短等特性[2];但是，菌絲容易老化、變異，且子實(shí)體產(chǎn)量及性狀容易受到環(huán)境條件的影響.如:高濃度NaCl中的氯離子對生物酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用，從而抑制菌絲生物量的積累[3];而酸、堿以及溫度也都會對菌絲體細(xì)胞內(nèi)不同酶的活性產(chǎn)生影響，從而影響其生長速度以及菌絲活力;特別是在4℃低溫下，草菇菌絲會發(fā)生自溶而死亡，子實(shí)體會發(fā)軟、液化和腐爛，使其栽培、推廣、以及采后保藏都受到嚴(yán)重的限制[4，5].因此，對于草菇響應(yīng)非生物脅迫的機(jī)制研究，特別是應(yīng)答低溫脅迫的研究顯得格外重要.

本實(shí)驗(yàn)室委托深圳華大基因研究院利用高通量測序(Solexa)技術(shù)對草菇菌株P(guān)Yd21、PYd15進(jìn)行了基因組測序及重測序[6]，這為研究草菇應(yīng)答非生物脅迫相關(guān)基因的篩選提供大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù).本研究以PYd21及PYd15的雜交子H1521為對象，系統(tǒng)的研究了酸堿度、鹽離子濃度、氧化脅迫以及4℃低溫脅迫的耐受情況，以期為研究草菇菌絲H1521應(yīng)答非生物脅迫分子機(jī)制的脅迫條件選擇提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

H1521為福建主栽品種“屏優(yōu)一號”分離獲得的2個無法正常出菇的單孢菌株P(guān)Yd15、PYd21通過雜交所獲得的可正常出菇異核體菌株，該菌種由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供，現(xiàn)保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號:ACCC52633.

1.2 方法

1.2.1 菌種的活化 將供試菌株H1521從PDA斜面中轉(zhuǎn)接到PDA平板上培養(yǎng)2－3代，待菌絲生長速度及形態(tài)特征穩(wěn)定后方可用于后續(xù)試驗(yàn).

1.2.2 pH 梯度試驗(yàn) 參照朱堅等[7]的食用菌生物學(xué)特性測定方法，設(shè)置 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 十個不同的pH梯度，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)，以生長最快的菌落為準(zhǔn)，當(dāng)菌落直徑達(dá)到1－2 cm時，在所有梯度的菌落邊緣畫線作為生長起始線;放回35℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)菌落即將長滿培養(yǎng)皿時，再畫終止線，并用尺子測量起始線與終止線之間的距離，計算菌絲生長速度并拍照，用DPS軟件進(jìn)行方差分析及差異顯著性分析.每個梯度選取3個重復(fù)，每個重復(fù)測定3個數(shù)值.

由于本研究目的在于探究H1521的耐脅迫能力，所設(shè)定的pH梯度范圍較廣，會存在萌發(fā)較慢的現(xiàn)象，對于極端pH下培養(yǎng)的菌塊如果在拍照時還未萌發(fā)，我們會將剩余的平板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 d，如還未見其萌發(fā)則認(rèn)為該梯度的pH對菌絲致死.

1.2.3 NaCl濃度梯度試驗(yàn) 將同一批配制好的PDA培養(yǎng)基定量分裝于三角瓶中，每瓶200 mL，并向各個三角瓶中分別添加不同量的 NaCl至終濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4 mol·L－1并進(jìn)行高壓滅菌，以未添加NaCl的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲為對照標(biāo)記為CK.接種、培養(yǎng)、菌絲觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同2.2.

1.2.4 不同H2O2添加濃度的耐受性試驗(yàn) 將同一批配制好的PDA培養(yǎng)基定量分裝與三角瓶中，每瓶200 mL進(jìn)行高壓滅菌.待培養(yǎng)基冷卻至不燙手但未凝固時，在超凈工作臺內(nèi)分別加入不同量的H2O2溶液，使終濃度分別為0.1、1、10和100 mmol·L－1混勻后立即分裝到滅菌過的90 mm培養(yǎng)皿中，并做好標(biāo)記，以未添加H2O2溶液的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲為對照標(biāo)記為CK.接種、培養(yǎng)、菌絲觀察及數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法同1.2.2.

1.2.5 不同時間4℃脅迫的耐受性試驗(yàn) 將活化過的平板菌種用8 mm的無菌打孔器取相同大小的菌種塊與新的PDA平板中置于35℃培養(yǎng)至菌落直徑1－2 cm，取長勢較好且長速一致的平板畫好初始線后放入4℃冰箱中開始計時，設(shè)定冷脅迫時間分別為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h.取出后立即放回 35 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，畫終止線，測定并計算菌絲的生長速度，用DPS軟件進(jìn)行方差分析及差異顯著性分析.每個梯度選取3個重復(fù)，每個重復(fù)測定3個數(shù)值.

2 結(jié)果與分析

2.1 H1521菌絲對培養(yǎng)基pH的耐受性分析

由圖1及圖2可知，草菇H1521的菌絲在pH為4－10的范圍內(nèi)均可生長，不同的pH對菌絲生長影響不同.其中pH為8時，H1521的菌絲濃密，生長速度為2.71 cm·d－1，與其他pH梯度下的生長速度差異極顯著.

圖1 不同pH梯度條件下草菇H1521的生長情況Fig.1 Growth status of H1521 mycelium under the conditions of different pH

另外，pH為3和12時菌絲均無法萌發(fā)，為其致死pH;而pH為11時，培養(yǎng)基中的菌塊在拍照4 d后開始萌發(fā)，但生長速度緩慢，故認(rèn)為其生長速度為0.

2.2 H1521菌絲對不同濃度NaCl的耐受性分析

由圖3及圖4可知，草菇H1521的菌絲在NaCl濃度為0.2 mol·L－1以下時可以較好生長，但菌絲生長速度會隨著NaCl濃度的升高逐漸減小;當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.2 mol·L－1以上時菌絲生長速度驟降，與對照有極顯著差異.NaCl濃度達(dá)到 0.4 mol·L－1時菌絲無法萌發(fā)，為菌絲的致死濃度.

圖2 pH對菌絲生長速度的影響Fig.2 Effect of pH on mycelial growth rate

圖3 不同NaCl濃度梯度下草菇H1521的生長情況Fig.3 Growth status of H1521 mycelium under different concentrations of NaCl

圖4 不同濃度NaCl對菌絲生長速度的影響Fig.4 Effect of different concentrations of NaCl on mycelial growth rate

2.3 H1521菌絲對不同濃度H2O2的耐受性分析

由圖5及圖6可知，草菇H1521的菌絲在H2O2濃度為1 mmol·L－1及以下時可以較好生長，當(dāng)濃度達(dá)到10 mmol·L－1時菌絲生長受到明顯抑制但仍可以萌發(fā)，此時菌絲的生長速度與CK相比有極顯著差異.但當(dāng)H2O2濃度達(dá)到100 mmol·L－1時菌絲沒有萌發(fā)的跡象，該濃度為菌絲的致死濃度.

圖5 不同H2O2濃度梯度下草菇H1521的生長情況Fig.5 Growth status of H1521 mycelium under different concentrations H2O2

2.4 不同時間低溫脅迫對菌絲生長的影響

如圖7所示，將H1521菌絲置于4℃下孵育0－4 h后菌絲并未自溶，將其放回35℃下繼續(xù)培養(yǎng)，可恢復(fù)正常生長.從圖中可以看出，不同時間低溫刺激后菌絲恢復(fù)的速度不同，0－1 h的生長速度有極顯著差異，之后隨著冷脅迫的時間增加菌絲恢復(fù)所需要的時間逐漸變長，生長速度逐漸變慢，但是總體較為接近.說明第1個小時的低溫脅迫對草菇影響較大，但總體來看短時的低溫脅迫對菌絲的傷害并不嚴(yán)重.建議4℃脅迫1 h可作為后期低溫脅迫機(jī)制研究的備選條件.

圖6 不同濃度H2O2對菌絲生長速度的影響Fig.6 Effect of different concentrations of H2O2on mycelial growth rate

圖7 不同時間4℃脅迫對菌絲生長速度的影響Fig.7 Effect of different durations of low temperature stress on mycelial growth rate

3 小結(jié)與討論

對食用菌的生物學(xué)特性的研究，是實(shí)現(xiàn)其人工栽培的重要前提.對草菇生物學(xué)特性的研究主要集中在溫度、pH以及培養(yǎng)基的配比上[1，8－11]，但是對于耐鹽性、耐氧化脅迫能力的研究還未見報道.本研究以背景清楚的測序菌株雜交子H1521菌絲為對象，詳細(xì)探討了培養(yǎng)基的pH、NaCl濃度、H2O2濃度以及不同時間低溫脅迫等因素對其生長的影響，為揭示草菇對各種非生物脅迫的耐受能力提供依據(jù).同時，試驗(yàn)結(jié)果將為研究草菇抵抗非生物脅迫機(jī)制及其脅迫條件的選擇提供參考.

[1]楊維麗，敖莉，李長田，等.草菇菌株的生物學(xué)特性比較[J].食用菌學(xué)報，2012，18(4):19－21.

[2]蔡愛軍，王鳳菊，楊文靜.草菇高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].中國食用菌，2005，24(4):50－50.

[3]黃藝，姜學(xué)艷，季海波，等.過量鈉鹽脅迫對種外生菌根真菌生長和鈉元素積累的影響[J].微生物學(xué)通報，2004，31(3):45－49.

[4]陳明杰，余智晟.草菇組織分離物的遺傳變異研究(Ⅱ)[J].食用菌學(xué)報，2000，7(2):1－4.

[5]段學(xué)斌，龐學(xué)群.草菇低溫貯藏及有關(guān)生理變化研究[J].熱帶作物學(xué)報，2000，21(4):75－79.

[6]MENG L，YAN J，XIE B，et al.Genes encoding FAD-binding proteins in Volvariella volvacea exhibit differential expression in homokaryons and heterokaryons[J].Microbiological Research，2013，168(8):533－546.

[7]朱堅.食用菌品種特性與栽培[M].福州:福建科學(xué)技術(shù)出版社，2011:14－15.

[8]伍國明，李梅.營養(yǎng)及培養(yǎng)溫度對草菇菌絲生長的影響[J].食用菌，2009，3:8－9.

[9]王偉科，周祖法，袁衛(wèi)東，等.不同營養(yǎng)因子和培養(yǎng)條件對草菇菌株V115菌絲生長的影響[J].北方園藝，2012(21):147－149.

[10]張萍，梁建光，楊立紅，等.草菇不同菌株的生物學(xué)特性研究[J].中國食用菌，2005，24(2):17－19.

[11]AKINYELE B J，ADETUYI F C.Effect of agrowastes，pH and temperature variation on the growth of Volvariella volvacea[J].African Journal of Biotechnology，2005，4(12):1390－1395.