張歡，鄭屹，王海青，周穎，周瑋，吳永根，黃學(xué)鋒

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖中心，溫州 325000）

在輔助生殖中，移植胚胎的發(fā)育潛能是影響臨床結(jié)果的重要因素［1］。因此，在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）過(guò)程中合理選擇高發(fā)育潛能的胚胎至關(guān)重要。目前胚胎評(píng)價(jià)主要基于胚胎的發(fā)育速度，以及胚胎的形態(tài)學(xué)。雖然各個(gè)輔助生殖中心的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有所差異，但評(píng)價(jià)卵裂期胚胎的指標(biāo)主要還是碎片程度、卵裂球的數(shù)目、均一度、形態(tài)、對(duì)稱性等指標(biāo)［2-4］。而囊胚期則主要評(píng)估囊腔大小、內(nèi)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的多少［5］。這些指標(biāo)能大致反映胚胎體外發(fā)育是否正常以及植入后發(fā)育潛能的大小。然而，一些研究［6-7］發(fā)現(xiàn)胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)合特定時(shí)間點(diǎn)胚胎發(fā)生事件可以提高胚胎的種植率。因此，一些學(xué)者認(rèn)為盡可能多了解胚胎發(fā)育信息有助于遴選高發(fā)育潛能的胚胎。近年興起的延時(shí)攝像胚胎觀測(cè)技術(shù)（time-lapse）能自動(dòng)獲取胚胎發(fā)育各個(gè)階段的形態(tài)以及各事件發(fā)生的特定時(shí)間，并能夠保證觀察過(guò)程中胚胎發(fā)育環(huán)境的穩(wěn)定，提供更多信息進(jìn)行胚胎挑選移植。本研究旨在分析比較timelapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對(duì)臨床結(jié)果的影響，探討time-lapse培養(yǎng)是否更有利于培育高潛能胚胎。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

選取2013年10月至2015年1月期間在本中心行體外受精／卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF／ICSI-ET）的110 例time-lapse 培 養(yǎng) 周 期 和2 274 例常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期的臨床結(jié)果。納入標(biāo)準(zhǔn)：因女方輸卵管因素、男方少弱畸精子癥、梗阻型無(wú)精子癥以及其他因素在我中心接受IVF／ICSIET 助孕治療的不孕不育患者。所有入選周期排除了女性子宮因素（如子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等）以及其他疾病因素（卵巢儲(chǔ)備功能下降、染色體臂間倒位、多囊卵巢綜合征等）。

所有入選周期受精數(shù)≥6 個(gè)，同時(shí)由于Primo Vision 胚胎培養(yǎng)皿（Vitrolife，瑞典）最多只能放置16個(gè)胚胎，所以所有入選周期受精數(shù)≤16個(gè)。實(shí)驗(yàn)中所有患者被隨機(jī)分配成time-lapse 組和常規(guī)IVF組。

二、方法

1.超排卵方案：采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案和短方案進(jìn)行。

2.精液處理：精液液化后，行IVF 的精液經(jīng)非連續(xù)密度梯度離心法處理后，在受精液（G-IVF Plus，Vitrolife，瑞典）中上游1h后備用；行ICSI的精液經(jīng)胚胎緩沖液（G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典）直接離心后備用。受精前按照WHO 標(biāo)準(zhǔn)［8］，分別檢測(cè)精液量，以及精子濃度和活動(dòng)率。

3.IVF／ICSI：注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，Merck Serono，德國(guó)）36h后經(jīng)陰道B 超引導(dǎo)下取卵，根據(jù)臨床指征行IVF 或ICSI。IVF 授精：分別將精子、卵母細(xì)胞加入到受精培養(yǎng)液滴中進(jìn)行受精。ICSI授精：卵母細(xì)胞經(jīng)過(guò)透明質(zhì)酸酶（Sigma，美國(guó)）剝除顆粒細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至G-MOPS Plus 滴中行ICSI。

4.胚胎培養(yǎng)：受精觀察后，常規(guī)組將正常受精胚胎轉(zhuǎn)移至卵裂培養(yǎng)滴（G-1Plus，Vitrolife，瑞典）并置于Thermo Forma培養(yǎng)箱中37°C、6%CO2條件下培養(yǎng)；time-lapse組將正常受精胚胎轉(zhuǎn)移至含卵裂培養(yǎng)滴并置于Thermo Forma培養(yǎng)箱內(nèi)的Primo vision胚胎監(jiān)測(cè)儀器（Vitrolife，瑞典）中37 ℃、6%CO2條件下培養(yǎng)。

5.胚胎質(zhì)量評(píng)估：常規(guī)組胚胎體外培養(yǎng)至第3天（D3），根據(jù)細(xì)胞數(shù)目、卵裂球的形態(tài)、均一度以及碎片進(jìn)行評(píng)分。優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)參照本生殖中心標(biāo)準(zhǔn)［9］。time-lapse組胚胎體外培養(yǎng)至D3，Primo vision分析系統(tǒng)（Vitrolife，瑞典）根據(jù)胚胎發(fā)育過(guò)程中每個(gè)事件的發(fā)生時(shí)間并結(jié)合D3形態(tài)學(xué)對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分。胚胎發(fā)生事件包括：第1 次卵裂時(shí)間（＜45min）、2細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間（20～32h）、2～3細(xì)胞的時(shí)間（8～12h）、3 細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間（31～42h）、3～4細(xì)胞的時(shí)間（＜75 min）、4 細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間（35～44h）、4～5細(xì)胞的時(shí)間（13～16h）、5細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間（49～57h）等。

6.胚胎移植和妊娠檢查：選擇評(píng)分最高的2～3枚胚胎進(jìn)行移植，以移植后4～6周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，率之間比較采用卡方檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對(duì)受精個(gè)數(shù)≤10周期臨床結(jié)果的影響

本研究共110例time-lapse培養(yǎng)周期和2 274 例常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)周期，所有入選周期的受精卵為6～16個(gè)，根據(jù)中位數(shù)劃分為受精卵＞10的周期（多胚胎周期）和受精卵≤10的周期（非多胚胎周期）。

其中65例time-lapse培養(yǎng)周期和1 618例常規(guī)IVF培養(yǎng)周期的受精個(gè)數(shù)介于6～10個(gè)。兩組的基本情況：年齡［（31.5±4.0）歲vs.（31.0±4.2）歲，P＞0.05］、體重指數(shù)（BMI）［（21.1±2.7）kg／m2vs.（21.5±2.9）kg／m2，P＞0.05］、不 育 年 限［（4.0±3.4）年vs.（3.8±2.7）年，P＞0.05］、原發(fā)不育率（32.3% vs.39.9%，P＞0.05）；兩組授精方 式：ICSI（15.4% vs.21.7%）、IVF （80.0% vs.67.9%）、IVF／ICSI（4.6% vs.10.4%），均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

兩組獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、ET 數(shù)、以及種植率和臨床妊娠率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

二、比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)對(duì)受精數(shù)＞10周期臨床結(jié)果的影響

共45個(gè)time-lapse培養(yǎng)周期和656 個(gè)常規(guī)培養(yǎng)周期的受精個(gè)數(shù)介于11～16。兩組的基本情況：年齡［（31.6±4.2）歲vs.（30.5±4.0）歲，P ＞0.05］、BMI［（21.0±2.5）kg／m2vs.（21.6±3.0）kg／m2，P＞0.05］、不 育年限［（3.9±3.3）年vs.（3.9±2.8）年，P＞0.05］、原發(fā)不育率（26.7%vs.39.6%，P＞0.05）；兩組授精方式：ICSI（28.9%vs.18.9%），IVF （64.4% vs.70.7%），IVF／ICSI（6.7%vs.10.4%），均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

兩組之間獲卵數(shù)、成熟數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、ET 數(shù)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但time-lapse培養(yǎng)周期的種植率和臨床妊娠率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)周期（P＜0.05）（表2）。

表1 受精數(shù)≤10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

表1 受精數(shù)≤10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

注：兩組比較，P 均＞0.05

組 別 周期數(shù)（個(gè)） 獲卵數(shù)（個(gè)） 成熟數(shù)（個(gè)） 受精數(shù)（個(gè)） 卵裂數(shù)（個(gè)）time-lapse培養(yǎng)周期65 11.8±3.2 10.5±2.7 7.8±1.3 7.5±1.3常規(guī)培養(yǎng)周期 1 618 12.1±3.4 10.6±2.7 7.8±1.4 7.6±1.5組 別 D3優(yōu)胚數(shù)（個(gè)） D3優(yōu)胚率 ET 數(shù)（個(gè)） 種植率 妊娠率time-lapse培養(yǎng)周期2.9±2.1 37.3 2.4±0.5 30.1 47.7常規(guī)培養(yǎng)周期2.6±1.9 34.3 2.3±0.4 35.4 55.5

表2 受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

表2 受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期臨床結(jié)果［（±s），（%）］

注：與timp-lapse培養(yǎng)周期比較，＊P＜0.05

組 別 周期數(shù)（個(gè)） 獲卵數(shù)（個(gè)） 成熟數(shù)（個(gè)） 受精數(shù)（個(gè)） 卵裂數(shù)（個(gè)）time-lapse培養(yǎng)周期45 17.1±2.9 15.6±2.7 13.0±1.9 12.2±2.6常規(guī)培養(yǎng)周期 656 17.4±3.6 15.9±3.0 12.6±1.6 12.2±1.8組 別 D3優(yōu)胚數(shù)（個(gè)） D3優(yōu)質(zhì)胚胎率 ET 數(shù)（個(gè)） 種植率 妊娠率time-lapse培養(yǎng)周期4.5±2.7 37.0 2.1±0.3 56.8 77.8常規(guī)培養(yǎng)周期 4.3±4.2 35.6 2.1±0.3 40.0＊ 57.5＊

討 論

本研究回顧性分析了2013年10月至2015年1月期間在本中心行IVF／ICSI-ET 的110例timelapse培養(yǎng)周期和2 274 例常規(guī)IVF 胚胎培養(yǎng)周期的臨床結(jié)果。我們分別比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)IVF胚胎培養(yǎng)對(duì)受精數(shù)≤10或＞10周期臨床結(jié)果的影響。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)受精數(shù)≤10 時(shí)，time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期的種植率、臨床妊娠率無(wú)顯著性差異，而當(dāng)受精數(shù)＞10時(shí)，time-lapse周期的種植率（56.8% vs.40.0%）和 臨 床 妊 娠 率（77.8%vs.57.5%）均顯著高于常規(guī)培養(yǎng)周期（P＜0.05）。

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，time-lapse儀器作為一種新的設(shè)備開始在各個(gè)臨床中心運(yùn)用。Timelapse可以在保持胚胎培養(yǎng)條件穩(wěn)定的情況下，通過(guò)每天24h連續(xù)非侵入性的胚胎觀察，捕捉胚胎發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)變化并進(jìn)行攝影成像［10-12］。最后通過(guò)軟件對(duì)胚胎各個(gè)發(fā)生事件的時(shí)間進(jìn)行標(biāo)記、記錄卵裂異常等行為，進(jìn)行分析后挑選胚胎移植。雖然time-lapse技術(shù)中平均每個(gè)胚胎需要在LED 光線下暴露約300次／d，但實(shí)際上總暴露時(shí)間小于50s／d，在過(guò)去的5～6年里，大量的研究已經(jīng)確認(rèn)了time-lapse技術(shù)的安全性［13-14］?，F(xiàn)今，各個(gè)中心主要使用Primo vision、Embryoscope、EEVA三種time-lapse監(jiān)測(cè)系統(tǒng)［15］。本研究采用Primo vision監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可以監(jiān)測(cè)掃描11 個(gè)聚焦平面，最短可保持每5min進(jìn)行一次圖片記錄，這非常有利于準(zhǔn)確捕捉胚胎一些動(dòng)態(tài)變化（比如，原核消失到2細(xì)胞的時(shí)間為30～35min）。

至今，尚無(wú)足夠的研究證實(shí)運(yùn)用time-lapse培養(yǎng)相比常規(guī)培養(yǎng)有可以獲得更高的臨床妊娠率和出生率。Siristatidis等［16］采用time-lapse培養(yǎng)技術(shù)獲得了比常規(guī)培養(yǎng)更高的臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率和出生率，尤其當(dāng)女性年齡＞40歲時(shí)，顯著性更加明顯。Azzarello等［17］運(yùn)用time-lapse觀察原核形態(tài)、記錄原核消失時(shí)間，發(fā)現(xiàn)原核消失時(shí)間遲于20h45 min 的胚胎其種植率顯著高于原核消失早于20h 45min 的胚胎。而Cruz等［14］則比較time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的胚胎質(zhì)量、囊胚形成率、臨床妊娠率等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Lemmen等［18］使用time-lapse系統(tǒng)培養(yǎng)102枚正常受精卵，發(fā)現(xiàn)D2時(shí)58%的胚胎到達(dá)4細(xì)胞階段，82%的胚胎可用于移植或冷凍，這同常規(guī)培養(yǎng)相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究中，當(dāng)受精數(shù)≤10時(shí)，time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的臨床結(jié)局無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但當(dāng)受精數(shù)＞10時(shí)，time-lapse培養(yǎng)的臨床妊娠率、種植率顯著高于常規(guī)培養(yǎng)。我們分析認(rèn)為：當(dāng)受精數(shù)≤10 個(gè)時(shí)，time-lapse培養(yǎng)周期和常規(guī)培養(yǎng)周期的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為（2.9±2.1）個(gè)和（2.6±1.9）個(gè)，根據(jù)臨床指征通常胚胎移植時(shí)需2～3枚胚胎，常規(guī)培養(yǎng)周期通過(guò)D3形態(tài)學(xué)評(píng)分可以選擇出僅有的2～3枚優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，而time-lapse培養(yǎng)周期運(yùn)用D3形態(tài)學(xué)評(píng)分結(jié)合早期胚胎發(fā)生事件時(shí)，由于優(yōu)質(zhì)胚胎往往卵裂時(shí)間和行為異常率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于低質(zhì)量胚胎，而且形態(tài)學(xué)本身就是個(gè)重要參考，因而timelapse挑選的優(yōu)勢(shì)不是很明顯；而當(dāng)受精數(shù)＞10時(shí)，time-lapse和常規(guī)培養(yǎng)周期的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)分別為（4.5±2.7）個(gè)和（4.3±4.2）個(gè)，形態(tài)學(xué)評(píng)分無(wú)法很好選擇最優(yōu)2～3枚胚胎進(jìn)行移植，此時(shí)運(yùn)用timelapse技術(shù)結(jié)合胚胎早期發(fā)生事件，可以避免移植那些D3形態(tài)學(xué)評(píng)分優(yōu)級(jí)但早期出現(xiàn)卵裂行為異常、卵裂時(shí)間異常以及出現(xiàn)多核細(xì)胞的胚胎。

此外，有研究［19］認(rèn)為time-lapse培養(yǎng)相對(duì)普通培養(yǎng)可以避免培養(yǎng)箱頻繁的開關(guān)，保持培養(yǎng)箱內(nèi)環(huán)境尤其是pH 和溫度的穩(wěn)定，有利于獲得高質(zhì)量的胚胎。但本研究中，無(wú)論受精數(shù)≤10或者＞10的周期，time-lapse培養(yǎng)和常規(guī)培養(yǎng)的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，我們認(rèn)為受精數(shù)＞10的time-lapse培養(yǎng)周期相對(duì)于常規(guī)培養(yǎng)周期的高種植率和高臨床妊娠率主要是通過(guò)優(yōu)選高發(fā)育潛能胚胎進(jìn)行移植而非提高胚胎質(zhì)量方式完成的。目前time-lapse挑選時(shí)參考的早期事件主要包括卵裂細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間和維持時(shí)間以及卵裂異常和多核等異常行為。本研究主要采用1～5卵裂球細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間和維持時(shí)間以及是否出現(xiàn)多核、卵裂異常等參數(shù)來(lái)判斷胚胎的發(fā)育潛能。這些參數(shù)在常規(guī)培養(yǎng)周期中無(wú)法觀察到，但在很多研究中證實(shí)是有利于胚胎篩選的。Meseguer等［20］分析認(rèn)為，5細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間、3～4 細(xì)胞的時(shí)間、2 細(xì)胞出現(xiàn)的時(shí)間，以及2～3細(xì)胞的時(shí)間有助于篩選高種植率的胚胎。Basile等［21］通過(guò)研究多中心的time-lapse數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)3細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間、5細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間、2～3細(xì)胞的時(shí)間與胚胎種植存在相關(guān)性，而多核、異常卵裂的胚胎發(fā)育潛能不高。

本研究證實(shí)，受精數(shù)＞10 的周期通過(guò)timelapse培養(yǎng)可以獲得比常規(guī)培養(yǎng)周期更高的臨床妊娠率和種植率。當(dāng)然本研究的樣本量比較少，同時(shí)僅僅以胚胎種植、臨床妊娠作為統(tǒng)計(jì)結(jié)局。下一步，我們考慮擴(kuò)大樣本量，并增加囊胚形成、出生率等指標(biāo)證實(shí)本結(jié)論。

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