李玉梅，桂寶恒，劉冬娥

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，長沙 410008）

隨著社會的進(jìn)步，生育年齡逐漸延遲，高齡妊娠越來越多，同時隨著我國二胎生育政策的開放，要求生育二胎的高齡患者也逐漸增多。眾所周知，年齡是獨(dú)立影響女性生育力的重要因素［1-2］，女性在37～38歲時卵巢的儲備卵泡數(shù)目明顯下降，婦女的生育能力急劇下降。輔助生殖助孕成功率隨著年齡增長而降低，卵母細(xì)胞獲取率和胚胎可利用率降低，而胚胎碎片率增加，移植成功率降低，同時活產(chǎn)率降低而流產(chǎn)率增加。盡管輔助生殖技術(shù)為不孕患者帶來了很多益處，但高齡患者成功并安全獲得足月妊娠分娩的幾率仍相對較低。如何提高高齡患者的妊娠率也是臨床醫(yī)師希望解決的一個重要臨床問題。

隨著冷凍技術(shù)的不斷提高，凍融胚胎移植（FET）已經(jīng)成為輔助生殖技術(shù)的一個重要組成部分。有文獻(xiàn)表明，凍融胚胎移植后其臨床妊娠率和活產(chǎn)率可達(dá)到甚至高于新鮮周期胚胎移植，同時，低體重兒及早產(chǎn)兒的出生比率低于鮮胚移植周期［3-7］。目前，全胚冷凍主要用于為防止卵巢過度刺激綜合征（OHSS）或因其他各種原因不能行鮮胚周期移植的患者［8-12］。實(shí)施全胚冷凍是否能夠改善高齡患者的臨床妊娠結(jié)局，降低圍產(chǎn)期母兒并發(fā)癥，目前文獻(xiàn)報(bào)道不多。本研究擬通過對2011年1月至2013年12月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心全胚胎冷凍后首次行FET 的147個周期高齡患者臨床結(jié)局的回顧性分析，探討全胚冷凍在高齡患者中的應(yīng)用價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2011年1月至2013年12月期間在本中心因各種原因行全胚冷凍且年齡≥38 歲的147個周期的患者臨床資料，進(jìn)行回顧性分析。

全胚冷凍原因包括：59 個周期（40.14%）行克羅米芬微刺激方案促排卵，內(nèi)膜發(fā)育不良取消移植；28個周期（19.05%）因存在卵巢過度刺激傾向取消移植；24個周期（16.33%）因移植日發(fā)現(xiàn)宮腔積液取消移植；13 個周期（8.84%）黃體期取卵，內(nèi)膜與胚胎發(fā)育不同步取消移植；10個周期（6.80%）取卵日發(fā)現(xiàn)孕激素升高取消移植；13個周期（8.84%）因感冒、腎結(jié)石絞痛、家人去世等個人原因取消移植。全胚冷凍患者取卵后休息2～3個月再行凍胚移植，休息期間無特殊治療。

同時選取同期內(nèi)年齡≥38歲的910個周期行新鮮胚胎移植的患者作為對照組。

二、控制性超促排卵和體外受精胚胎培養(yǎng)

根據(jù)患者的具體情況采用標(biāo)準(zhǔn)短效長方案或改良短方案或微刺激方案促排卵，當(dāng)3個或以上卵泡平均直徑≥18～20 mm 時肌注人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫(yī)藥）5 000～10 000U 促卵母細(xì)胞進(jìn)一步成熟，34～36h 后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵，按我中心的操作規(guī)則常規(guī)行IVF／ICSI及胚胎培養(yǎng)觀察。如因各種原因不能行鮮胚移植，則將取卵后第3天（D3）可移植卵裂期胚胎行玻璃化冷凍。如無特殊情況，患者行第3天卵裂期胚胎移植，剩余可移植卵裂期胚胎亦行玻璃化冷凍。

三、卵裂期胚胎評級

根據(jù)我中心的胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)，綜合胚胎卵裂速度、卵裂球均勻程度及碎片比例，卵裂期胚胎分為4級。Ⅰ級胚胎：受精后第3天卵裂球7～10細(xì)胞，卵裂球大小均一，碎片＜5%；Ⅱ級胚胎：受精后第3天卵裂球7～10細(xì)胞，卵裂球大小較均一，5%≤碎片≤20%；Ⅲ級胚胎：第3天卵裂球5～10細(xì)胞，碎片比例21～49%；Ⅳ級胚胎：碎片比例≥50%。Ⅰ～Ⅱ級胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ～Ⅲ級胚胎為可移植胚胎。

四、FET 周期子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備

1.自然周期：月經(jīng)周期規(guī)律患者于月經(jīng)第10天開始定期B 超監(jiān)測卵泡發(fā)育，排卵后第3天行胚胎移植，同時口服黃體酮膠丸（浙江愛生藥業(yè)）200mg／d進(jìn)行黃體支持。

2.激素替代周期：對于月經(jīng)周期不規(guī)律或有排卵障礙的患者，于月經(jīng)第3天開始口服戊酸雌二醇（拜耳醫(yī)藥，德國）6 mg／d，月經(jīng)第10 天開始定期B超監(jiān)測子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，同時根據(jù)內(nèi)膜發(fā)育情況調(diào)整戊酸雌二醇劑量；當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時，加用微?；S體酮陰道栓劑（安琪坦，華杏制藥，瑞士）600mg／d陰道給藥行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，3d后行卵裂期胚胎解凍移植。

五、凍融胚胎解凍移植

胚胎解凍后有50%以上卵裂球存活的胚胎為存活胚胎。常規(guī)移植2枚存活胚胎。移植胚胎全部為D3卵裂期胚胎。同時，為降低多胎妊娠率的發(fā)生，我中心規(guī)定所有患者移植胚胎數(shù)均≤2 枚。移植2周后常規(guī)進(jìn)行血HCG 的測定，陽性者3 周后行陰道超聲檢查，宮腔內(nèi)見孕囊為臨床妊娠。

六、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，多因素變量與臨床結(jié)局采用Logistic回歸分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者一般資料的比較

研究組（FET 組）平均年齡大于對照組（鮮胚移植組），Gn用量及用藥天數(shù)低于對照組，平均可移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)高于對照組，移植日子宮內(nèi)膜厚度薄于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；兩組間不孕年限、體重指數(shù)、基礎(chǔ)FSH 濃度、平均獲MII卵數(shù)、平均移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表1）。

二、兩組患者臨床結(jié)局比較

比較兩組間的臨床妊娠結(jié)局，臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、多胎率等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；研究組妊娠周數(shù)及新生兒（雙胎）出生體重均高于對照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；而研究組單胎出生體重顯著高于對照組（P＜0.05），單胎和雙胎的早產(chǎn)發(fā)生率及妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率則顯著低于對照組（P＜0.05）（表2、表3）。

三、多因素對單胎體重影響的Logistic回歸分析

因研究組與對照組在年齡、優(yōu)胚獲得率及內(nèi)膜厚度等方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而妊娠結(jié)局中研究組單胎體重明顯高于對照組，因此采用Logistic回歸分析比較多因素對單胎體重的影響。結(jié)果表明，各因素單獨(dú)對結(jié)局的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表4）。

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

表1 兩組患者一般資料比較（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) 年齡（歲）不孕年限（年）體重指數(shù)（kg／m2）基礎(chǔ)FSH（U／L）Gn天數(shù)（d）Gn用量（U）研究組 147 41.18±2.97＊ 7.63±5.11 22.34±2.59 9.07±5.22 8.57±4.72＊ 2 289.18±2 338.44＊對照組 910 40.35±2.33 7.50±5.19 22.59±2.59 9.57±4.46 10.80±2.24 2 802.41±894.95組 別 例數(shù) MII卵數(shù)（枚）移植胚胎數(shù)（枚）研究組 147 6.71±6.20 4.56±4.38＊ 3.50±3.69＊ 9.27±2.04＊可移植胚胎數(shù)（枚）優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚）移植日內(nèi)膜厚度（mm）1.95±0.49對照組 910 6.06±3.44 3.53±2.47 2.91±2.12 10.52±2.3 3 1.96±0.51

表2 兩組患者臨床妊娠結(jié)局比較

表3 兩組患者孕周數(shù)及新生兒體重比較（±s）

表3 兩組患者孕周數(shù)及新生兒體重比較（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與單胎比較，＃P＜0.05

孕 周新生兒出生體重（g）組 別 例數(shù)單胎 多胎 單胎 多胎研究組 147 39.7±1.6 36.5±0.6＃ 3 521±377＊ 2 650±265＃對照組 910 38.6±1.8 35.9±0.6＃ 3 166±624 2 522±588＃

表4 多因素對單胎體重影響的Logistic回歸分析

討 論

本文回顧性分析了147個周期全胚冷凍后行凍融胚胎移植的高齡患者的臨床結(jié)局，研究結(jié)果表明：凍胚移植周期的臨床妊娠率和活產(chǎn)率與鮮胚移植周期相似；與鮮胚移植周期相比雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是凍胚移植周期的單胎和多胎的孕齡有所增加；同時，凍胚移植周期的單胎出生體重明顯高于鮮胚移植周期；早產(chǎn)發(fā)生率和妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率均明顯低于鮮胚移植組。

有文獻(xiàn)［4-5，13-16］表明年輕卵巢儲備功能正常的患者實(shí)施輔助生殖助孕后全胚冷凍，行凍融胚胎移植可獲得優(yōu)于鮮胚移植的臨床妊娠率和圍產(chǎn)期結(jié)局。與文獻(xiàn)報(bào)道相似，本研究中全胚冷凍的高齡患者，實(shí)施凍胚移植后，臨床妊娠率與鮮胚移植組相似，但單胎出生體重明顯高于鮮胚移植組；通過Logistic回歸分析，兩組中年齡、內(nèi)膜厚度、所獲優(yōu)胚數(shù)等各項(xiàng)因素的差異對單胎出生體重的影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時研究組的早產(chǎn)率和妊娠期并發(fā)癥明顯低于鮮胚移植組，獲得了更好的圍產(chǎn)期結(jié)局。目前導(dǎo)致這種結(jié)局的具體機(jī)制還不清楚，分析可能的原因是：（1）目前，評價胚胎發(fā)育潛力的標(biāo)準(zhǔn)仍以胚胎的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為主，鮮胚移植時主要是挑選形態(tài)學(xué)好的胚胎進(jìn)行移植，但形態(tài)學(xué)好的胚胎不一定代表了胚胎的真實(shí)發(fā)育潛能，而經(jīng)過胚胎冷凍和解凍過程，可能發(fā)育潛力差的胚胎被淘汰，篩選出了更優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植，從而能夠獲得更好的妊娠結(jié)局；（2）鮮胚移植周期超生理濃度的甾體激素水平可能影響胎盤形成和胎盤功能，進(jìn)而影響臨床結(jié)局；（3）本研究中全胚冷凍組平均獲得的可移植胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均高于鮮胚移植組，而平均獲優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)較多者，移植胚胎時可選擇高質(zhì)量胚胎的幾率更高，同樣可能影響到妊娠結(jié)局。

查閱隨訪資料，本研究中妊娠期并發(fā)癥主要為妊娠期高血壓疾病及發(fā)生在妊娠37周前的胎膜早破，對于妊娠37周之后發(fā)生的胎膜早破，沒有隨訪，因此無法納入統(tǒng)計(jì)。高齡是妊娠高血壓疾病的高危因素之一，而該疾病和胎膜早破是影響妊娠圍產(chǎn)期結(jié)局的主要原因之一，本研究中全胚冷凍組妊娠高血壓疾病及胎膜早破發(fā)生率均明顯低于鮮胚移植組，從而獲得了更好的圍產(chǎn)期結(jié)局。因此，根據(jù)本文研究結(jié)果，可考慮通過全胚冷凍來改善高齡患者的圍產(chǎn)期結(jié)局，值得大樣本的前瞻性研究來證實(shí)。

眾所周知，在輔助生殖助孕中，獲得成功妊娠的影響因素包括優(yōu)質(zhì)胚胎與內(nèi)膜的成功對話從而植入內(nèi)膜繼續(xù)發(fā)育。與優(yōu)質(zhì)胚胎相比，內(nèi)膜容受性在多大程度上影響優(yōu)質(zhì)胚胎的植入，目前沒有肯定答案。Shapiro等［5］研究表明：與凍胚移植組比較，與內(nèi)膜容受性相關(guān)的多個基因的表達(dá)在促排卵周期組患者內(nèi)膜中發(fā)生下調(diào)，而凍胚移植則消除了高劑量Gn及高甾體激素濃度對內(nèi)膜的影響，因此認(rèn)為凍胚移植優(yōu)于鮮胚移植。本研究中全胚冷凍組與鮮胚移植組相比，種植率、臨床妊娠率、多胎率、流產(chǎn)率均無顯著性差異，與文獻(xiàn)結(jié)果有所不同。分析可能的原因：本研究為回顧性分析，存在選擇性偏倚，同時樣本量較小，因此需要大樣本的前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)。同時，需要優(yōu)化胚胎評價系統(tǒng)，從而更客觀科學(xué)地判斷胚胎的發(fā)育潛力，也有利于判斷胚胎與內(nèi)膜對成功建立妊娠的影響。

本研究中凍胚移植組患者平均年齡顯著高于鮮胚移植組，但促性腺激素用藥天數(shù)和用藥劑量卻顯著低于對照組，分析可能的原因在于促排卵方案的不同：在我院生殖中心，根據(jù)個體化用藥原則，年齡越大或卵巢儲備功能越差，偏向于改良短方案或克羅米芬微刺激方案促排卵，而對于相對較年輕或卵巢儲備功能好的患者一般采用標(biāo)準(zhǔn)的短效長方案。而短效長方案患者相應(yīng)的用藥天數(shù)和用藥量會高于改良短方案和微刺激方案的患者。本文中凍胚移植組促排卵方案中：長方案36周期（24.5%），短方案32周期（21.8%），微刺激方案及黃體期促排卵共72周期（50.0%），超長方案7周期（4.8%）；而鮮胚移植組中長方案804周期（88.4%），短方案83周期（9.1%），超長方案23周期（2.5%）。凍胚移植組以微刺激方案促排卵為主，而鮮胚移植組主要以長方案促排卵為主，因此凍胚移植組的用藥劑量及用藥天數(shù)會明顯少于對照組。雖然凍胚移植組患者年齡大于鮮胚移植組，但平均獲卵數(shù)相似，而平均可移植胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均高于鮮胚移植組，可能的原因在于用藥劑量相對較少，減少了藥物對卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，因而能獲得更多的優(yōu)質(zhì)胚胎，從而獲得更好的臨床妊娠結(jié)局。

大量研究已證實(shí)，單胎妊娠圍產(chǎn)期并發(fā)癥及預(yù)后優(yōu)于多胎妊娠。為降低母兒圍產(chǎn)期并發(fā)癥，改善臨床妊娠結(jié)局，降低多胎妊娠率，我中心從2010年開始減少了胚胎移植數(shù)目，不論年齡大小，平均移植胚胎不超過2個，因此本研究中兩組平均移植胚胎數(shù)較少（1.95±0.49vs.1.96±0.51）。可以明顯看出，不論是凍胚移植組還是鮮胚移植組，雙胎新生兒妊娠周數(shù)及出生體重均明顯低于單胎新生兒。

雖然本研究結(jié)果表明高齡患者行全胚冷凍后行凍胚移植能獲得與鮮胚移植相似甚至優(yōu)于鮮胚移植的臨床結(jié)局，同時圍產(chǎn)期結(jié)局明顯優(yōu)于鮮胚移植組，但全胚冷凍后再行凍胚移植不論在時間上還是經(jīng)濟(jì)上都增加了患者的負(fù)擔(dān)，目前不適合全面推廣，尚需經(jīng)過大樣本的前瞻性研究來進(jìn)一步證實(shí)。

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