丁錦麗，楊菁＊，張艷，張怡，徐望明，龍文

（1.武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院計劃生育研究所／生殖醫(yī)學中心，武漢 430030）

凍融胚胎移植（FET）不但能提高患者的累計妊娠率，還能預防重度卵巢過度刺激綜合征（OHSS）的發(fā)生［1-2］，隨著胚胎冷凍技術的發(fā)展，F(xiàn)ET 在臨床上的應用日趨廣泛。影響FET 臨床結局的因素很多，包括女方年齡、胚胎量、子宮內膜容受性、胚胎復蘇后存活率及胚胎發(fā)育與子宮內膜的同步性等［3-6］。凍融受精第3天（D3）胚胎移植和凍融囊胚移植各有優(yōu)勢，D3 胚胎降低了外界環(huán)境對胚胎發(fā)育的影響，但移植的胚胎數(shù)較多，而后者有較好的種植潛能，但某些患者（如獲取胚胎數(shù)較少的患者）并不適用［7］。關于選擇凍融D3胚胎移植還是凍融囊胚移植還存在爭議。我們在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，冷凍的卵裂期胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)18～24h，移植時部分胚胎已發(fā)育為囊胚，對于此類胚胎的植入情況少有文獻探討。本文回顧性分析和探討了FET 周期中不同發(fā)育速度的胚胎的植入能力。

資料與方法

一、研究對象

收集2012年1月至2013年12月在武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心行輔助生殖技術助孕的1 547對夫婦的資料。

納入標準：凍胚移植周期；D3胚胎均為優(yōu)質胚胎；女方年齡21～42歲，平均年齡31.20±3.64歲，不孕時間1～16年，不孕原因包括子宮內膜異位癥、輸卵管盆腔因素等女方因素以及免疫因素、男方因素及不明原因不孕。

二、方法回顧

1.促排卵、受精及內膜準備：采用我中心常規(guī)方案促排［8］。超聲檢查發(fā)現(xiàn)有3 個以上直徑≥18mm的卵泡時，注射HCG（雪蘭諾，瑞士）5 000～10 000U，36h后陰道超聲引導下采卵。根據(jù)男方精子質量決定卵胞漿內單精子注射（ICSI）授精或自然受精。

內膜準備方案包括自然周期和人工周期。自然周期適用于月經(jīng)規(guī)律的患者，于月經(jīng)周期第8～10天陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，利用血清促黃體生成素（LH）及雌激素（E2）水平評估排卵時間，排卵后3d行FET；月經(jīng)不規(guī)則、排卵障礙或內膜發(fā)育不佳的患者采用人工周期準備內膜，即于月經(jīng)周期第2～3天行陰道超聲，根據(jù)患者的情況決定戊酸雌二醇（補佳樂，先靈，德國）的起始用量及持續(xù)用量，待子宮內膜≥8mm 并出現(xiàn)三線征時，肌注黃體酮，3d后移植。

2.胚胎凍融、培養(yǎng)及移植：將D3 胚胎冷凍保存。胚胎冷凍按玻璃化法冷凍試劑盒（Kitazato，日本）進行；患者肌注黃體酮的第3天采用解凍試劑盒（Kitazato，日本）解凍胚胎，一般解凍2～3枚胚胎，具體操作按說明書進行；胚胎解凍后繼續(xù)轉入Quinn’s培養(yǎng)液（SAGE，美國）培養(yǎng)18～24h，于胚胎解凍第2天上午行移植，具體操作采用本中心常規(guī)方案［9］。解凍后未移植的胚胎，根據(jù)其質量決定繼續(xù)凍存或丟棄。

根據(jù)患者情況決定移植的胚胎數(shù)，一般為2～3枚。所有患者在移植后均肌注黃體酮行黃體支持及口服戊酸雌二醇。

3.胚胎質量評估：D3、解凍后及移植時各評估1次。D3評估時包含6 個以上均勻一致的卵裂球且細胞碎片小于20%的胚胎定義為優(yōu)質胚胎［8］；移植時形成囊胚的胚胎根據(jù)Gardner 囊胚評分標準［10］進行評估。

三、分析指標

本項研究分析了所有周期女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)（BMI）、內膜厚度、移植胚胎數(shù)、胚胎著床數(shù)以及胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)的情況等資料。

評價標準及方法：FET 后12～14d 檢測血β-HCG＞10U／L，2周后B 超下見孕囊確定為臨床妊娠；移植時形成囊胚的比例定義為移植時形成囊胚的胚胎數(shù)／解凍后存活的胚胎數(shù)×100%；胚胎種植率定義為孕囊數(shù)／移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率確定為臨床妊娠例數(shù)／總周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率為流產(chǎn)例數(shù)／（臨床妊娠例數(shù)-失訪數(shù)）×100%；活產(chǎn)率為（單胎例數(shù)＋多胎例數(shù)）／（臨床妊娠例數(shù)-失訪數(shù)）×100%；多胎率定義為多胎妊娠例數(shù)／（臨床妊娠例數(shù)-失訪數(shù)）×100%。在本研究中，所有多胎均為雙胎，且所有失訪周期均為已確診為臨床妊娠的周期。

四、統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行分析。定量資料比較采用t檢驗，定性資料的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、患者基本資料

本研究共納入1 547個FET 周期，有8個周期因解凍后胚胎全部溶解而取消FET。在剩余的1 539個周期中，根據(jù)移植胚胎是否包含囊胚這一指標，將研究對象分為2組，即無囊胚形成組（1 426個周期）和囊胚形成組（113個周期）；根據(jù)形成的囊胚數(shù)再將囊胚形成組分為1個囊胚組（78個周期）和1個以上（2個和3個）囊胚組（35個周期）（表1）。

1 539個FET 周期在新鮮周期的情況如表1所示。無囊胚形成組與囊胚形成組及其亞組（1個囊胚組及1個以上囊胚組）之間的采卵時女方的年齡、不孕因素、不孕時間及優(yōu)質胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；囊胚形成組的獲卵數(shù)較無囊胚形成組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）（表1）。

無囊胚形成組和囊胚形成組（1個囊胚組、1個以上囊胚組）組間的患者年齡、不孕年限、HCG 日子宮內膜厚度、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）（表1）。

二、胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)情況

1 539個周期中，共解凍3 753枚胚胎，解凍后存活3 577枚，胚胎復蘇率為95.31%。

移植當日評估：共153枚發(fā)育為囊胚，形成囊胚的比例為4.28%（153／3 577）。其中8-細胞以下胚胎（6-細胞胚胎、7-細胞胚胎）共1 117枚，解凍后存活1 053枚，9枚發(fā)育為囊胚，故8-細胞以下胚胎形成囊胚的比例為0.85%（9／1 053）；8-細胞胚胎共2 431枚，解凍后存活2 324枚，121枚發(fā)育為囊胚，即8-細胞胚胎形成囊胚的比例為5.21%（121／2 324）；205枚融合胚胎解凍后存活200枚，23枚發(fā)育為囊胚，囊胚形成的比例為11.50%（23／200）。8-細胞以下胚胎組、8-細胞胚胎組、融合胚胎組組間形成囊胚的比例均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）（表2）。

三、患者的妊娠結局比較

1 547個周期中，有8個周期因解凍后胚胎全部溶解而取消FET。剩余1 539個周期的臨床結局見表3。

在蕪湖當日，早早醒來，踱步江邊，眾人或快走，或慢跑，或閑步遛狗……江中運沙的駁船鱗次櫛比。一位老者以簡易絲網(wǎng)，正在水流湍急的江邊捕魚，方才六點鐘，已網(wǎng)上一兩斤小鯧魚，微型制氧機在鐵桶的水里制造出無數(shù)咕嚕嚕的小泡兒。那些小魚與老家小河里的模樣近似，翹嘴鯧的一種。望著這些魚兒，心底有什么東西仿佛又一次復活了。

無囊胚形成組與囊胚形成組的種植率及臨床妊娠率均有顯著差異（P＜0.01）；與無囊胚形成組相比，1個以上囊胚組的種植率、臨床妊娠率也顯著增高（P＜0.01）；1個以上囊胚組的種植率及臨床妊娠率均顯著高于1個囊胚組（分別為P＜0.01和P＜0.05）；1個囊胚組的種植率、臨床妊娠率較無囊胚形成組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）（表3）。

無囊胚形成組與囊胚形成組之間的流產(chǎn)率及活產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；囊胚形成組及兩個亞組的多胎率較無囊胚形成組均有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），其中無囊胚形成組與1個以上囊胚形成組比較多胎率趨勢較明顯（P 值為0.082）（表3）。

四、logistic分析結果

將本項研究納入的參數(shù)，即采卵時女方年齡、獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及BMI、不孕時間、移植個數(shù)及移植的囊胚數(shù)（即移植的胚胎中包含的囊胚數(shù)）等作logistic分析，結果提示移植個數(shù)及移植的囊胚數(shù)與臨床妊娠顯著相關（P＜0.05）（表4）。

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

表1 患者基本資料［（±s），n（%）］

注：＊患者不孕原因可兼具多項

組 別 周期數(shù) 年齡（歲） 原發(fā)不孕 不孕時間（年）不孕原因＊男性不孕 女性不孕 不明原因無囊胚形成組 1 426 31.16±4.44 680（47.69） 4.73±3.40 450（31.56） 12 04（84.43） 15（1.05）囊胚形成組 113 31.44±4.48 48（42.48） 4.71±2.88 28（24.78） 100（88.50） 3（2.65） 1個囊胚組 78 31.65±4.56 34（43.59） 4.77±2.81 20（25.64） 70（89.74） 2（2.56） 1個以上囊胚組 35 30.97±4.27 14（40.00） 4.57±3.09 8（22.86） 30（85.71） 1（2.86）組別 周期數(shù) BMI（kg／m2）采卵年齡（歲）獲卵數(shù)（枚）內膜厚度（cm）優(yōu)質胚胎數(shù)（枚）移植胚胎數(shù)（枚）0.14 8.09±4.53 2.29±0.53囊胚形成組 113 21.68±3.18 30.41±4.39 17.31±7.13 0.84±0.14 8.61±4.81 2.35±0.50 1個囊胚組 78 21.60±3.27 30.39±4.39 17.17±7.46 0.84±0.15 8.53±5.21 2.33±0.50 1個以上囊胚組 35 21.86±3.03 30.46±4.47 17.63±6.41 0.84±0.無囊胚形成組 1 426 21.85±3.10 29.99±4.38 16.14±6.67 0.85±12 8.80±3.83 2.40±0.50

表2 胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)情況［n（%）］

表3 患者臨床結局［n（%）］

表4 臨床妊娠的多因素logistic回歸分析結果

討 論

FET 在減少移植胚胎數(shù)及增加患者累計妊娠率的同時，能減輕反復促排卵、采卵給患者帶來的身體創(chuàng)傷和經(jīng)濟負擔，且能降低發(fā)生重度OHSS及多胎妊娠的風險，增加了人類輔助生殖技術的安全性［1-2］。近年來，隨著胚胎冷凍與胚胎復蘇技術的不斷發(fā)展與改進，F(xiàn)ET 已逐漸趨向成熟。在臨床工作中我們發(fā)現(xiàn)，冷凍的卵裂期胚胎復蘇后繼續(xù)培養(yǎng)18～24h，部分胚胎在移植時已發(fā)育為囊胚，本文對這類胚胎的植入潛能進行了分析與探討。

本研究所納入的研究對象均為在我中心行FET 的1 547例患者，均采用玻璃化冷凍的方式凍存胚胎，避免了不同冷凍方法對胚胎質量以及后續(xù)臨床結局的影響。研究對象按照移植時胚胎形態(tài)分為無囊胚形成組及囊胚形成組，組間患者的年齡、不孕年限、移植胚胎數(shù)、內膜厚度等基礎資料均無顯著差異，無囊胚形成組與囊胚形成組的種植率及臨床妊娠率有統(tǒng)計學差異，且1個以上囊胚組較1個囊胚組及無囊胚形成組的種植率及臨床妊娠率高，logistic分析結果也表明移植的囊胚數(shù)與臨床妊娠密切相關，提示移植時已形成囊胚的胚胎更容易著床，其中卵裂期8-細胞胚胎組及融合胚胎組更容易發(fā)育為囊胚。

人類胚胎通常在D5 或D6 發(fā)育至囊胚階段。通常，F(xiàn)ET 周期中D3移植解凍后的卵裂期胚胎，而D5／D6移植囊胚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，部分解凍后的卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)18～24h后已發(fā)育為囊胚，且其植入潛能更好，即這部分胚胎發(fā)育的速度較快，且有較好的臨床結局。子宮內膜只在一段很短的時間內允許胚胎著床，此時子宮內膜的容受性最高，這段時間即子宮內膜種植窗。不同種屬的種植窗不同，嚙齒類動物子宮內膜的種植窗開放時間不到24h，而人類可達4d。有研究表明，人類子宮內膜種植窗在排卵后10d左右開啟，即人類的胚胎有較長的時間選擇著床［11］。囊胚移植更接近生理妊娠過程，在輸卵管中發(fā)育的早期胚胎發(fā)育接近囊胚期時進入子宮腔，因其縮短了胚胎移植入宮腔后再發(fā)育與著床之間的時間間隔，而且此時子宮收縮逐漸減少，利于胚胎著床。因而，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有較高的種植率和臨床妊娠率［12-13］。本研究結果也支持這一結論。有研究表明，復蘇的D3 胚胎經(jīng)過夜培養(yǎng)后，有胚胎發(fā)育至桑葚胚的周期的種植率及妊娠率均顯著高于胚胎未發(fā)育至桑葚胚的周期［14-15］，但本研究中沒有分析發(fā)育至桑椹胚胚胎的比例。

多胎妊娠被認為是輔助生殖技術的并發(fā)癥，降低多胎妊娠的措施包括減胎術及減少移植胚胎的數(shù)量兩種方法，目前認為降低多胎妊娠的最佳方法是單胚胎移植［25］。有結果表明，選擇性單胚胎移植可在總體妊娠率和分娩率不受影響的情況下，降低約1%的雙胎妊娠率［26］。也有研究證實移植單卵裂期胚胎／單囊胚移植周期較雙卵裂期胚胎移植周期顯著降低了多胎率，但臨床妊娠率也降低，即單個胚胎不能在降低多胎率的同時維持妊娠率［27-28］。移植單個胚胎可以杜絕雙卵雙胎的發(fā)生，但是無選擇地對患者移植單個胚胎無疑從一定程度上降低了臨床妊娠率［27］。選擇性單囊胚移植被認為是解決多胎妊娠及維持累計妊娠率的關鍵［29］，但囊胚移植對于某些患者（如胚胎較少）來說并不適合［7］。我們的研究結果表明，在無囊胚形成組與囊胚形成組及兩個亞組的活產(chǎn)率及流產(chǎn)率均無顯著差異的背景下，囊胚形成組及兩個亞組的多胎率較無囊胚形成組有升高趨勢，其中1個以上囊胚組的趨勢更為明顯。因此我們認為，對于凍融后移植時已有囊胚形成，尤其是有1個以上囊胚形成的患者，可以考慮行選擇性單胚胎移植。

FET 周期中，囊胚移植篩選了凍存的胚胎，使更優(yōu)質的胚胎可用于移植，且囊胚與子宮內膜發(fā)育更同步，其更接近生理妊娠過程，因而囊胚移植有較好的臨床結局。本研究表明，卵裂期優(yōu)質胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)18～24h，部分胚胎可能已發(fā)育為囊胚，且這些胚胎的種植率及臨床妊娠率較移植時未發(fā)育為囊胚者更高。對于移植時已有囊胚形成，尤其是有1個以上囊胚形成的患者，可以考慮行選擇性單胚胎移植。

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