王雅琴，楊菁，徐望明，吳庚香

（武漢大學人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，武漢 430060）

在輔助生殖技術（ART）中，對低等級胚胎的處理一直是生殖領域棘手的難題，一方面低等級胚胎移植后種植率低，另一方面冷凍后復蘇率低。這部分胚胎是直接廢棄，還是有繼續(xù)利用的臨床價值？目前在生殖醫(yī)學界尚無明確定論。隨著囊胚體外培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，囊胚培養(yǎng)作為一種對胚胎發(fā)育潛能進一步篩選的方法，已被廣泛應用于臨床［1］。由于囊胚培養(yǎng)有一定的淘汰率，既往的研究認為，當?shù)?天（D3）有3個以上8細胞的優(yōu)質(zhì)胚胎時，可以考慮行囊胚培養(yǎng)篩選優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，從而提高種植率及臨床妊娠率［2］。但對于多個低等級胚胎，囊胚培養(yǎng)是否有助于其篩選出有發(fā)育潛能的胚胎、增加妊娠機會，仍有待臨床進一步考證。本研究主要應用鮮胚周期D3的低等級胚胎繼續(xù)進行體外囊胚培養(yǎng)，觀察囊胚形成情況及相關臨床資料，并進一步追蹤鮮胚周期未妊娠續(xù)行凍融周期囊胚移植患者的臨床妊娠結(jié)局，以評價低等級胚胎行囊胚培養(yǎng)及移植的可行性，為提高低等級胚胎的有效利用和臨床囊胚移植尋找理論依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

選擇2012年1月至2014年3月在我院生殖醫(yī)學中心接受體外受精-胚胎移植或卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植（IVF-ET／ICSI-ET）的679例不孕癥患者684個周期不符合凍存標準的3 536個剩余低等級胚胎進行囊胚培養(yǎng)，回顧性分析患者鮮胚周期各臨床指標參數(shù)以及鮮胚未妊娠凍融囊胚復蘇后的臨床妊娠情況。本研究得到了醫(yī)院倫理委員會的批準，并與患者簽署知情同意書。

二、方法

1.臨床促排卵方案和移植時間：促性腺激素釋放激素激動劑（GnRH-a，達必佳，輝凌公司，德國）0.1mg／d注射后14～16d達到垂體降調(diào)節(jié)后給予促性腺激素，陰道B 超監(jiān)測卵泡直徑發(fā)育至至少有兩個主導卵泡的直徑達18mm 以上時，注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠）8 000～10 000U，36～37h后經(jīng)陰道超聲下穿刺取卵，取卵后72h選取2個胚胎進行移植。

2.囊胚培養(yǎng)和囊胚評級：將新鮮胚胎移植后（或全胚冷凍周期）D3剩余的優(yōu)胚進行冷凍，其它低等級胚胎轉(zhuǎn)行囊胚培養(yǎng)，使用Quinns AdvantageTM囊胚培養(yǎng)基（SAGE，美國）進行胚胎體外培養(yǎng)。本研究中低等級胚胎的納入標準是D3低等級胚胎數(shù)≥4個，胚胎卵裂球數(shù)在3～5 個、胚胎碎片在5%～20%。卵裂球數(shù)＜3個細胞或碎片＞20%的質(zhì)量極差胚胎不納入本研究低等級胚胎中。所有低等級胚胎行囊胚序貫培養(yǎng)至D5／D6，觀察是否有囊胚形成，并對形成的囊胚選用Gardner等［3］分級方法進行分級，D5評分≥3BB 為優(yōu)質(zhì)囊胚，≥3CC 行囊胚玻璃化冷凍保存。

3.解凍囊胚并行凍融周期囊胚移植：采用人工周期或自然周期準備內(nèi)膜，在黃體酮注射5d后進行超聲引導下囊胚移植。囊胚在移植前1d解凍并體外培養(yǎng)。

4.妊娠確認：移植后12d抽血測HCG，陽性者診斷為生化妊娠，移植后30d行陰道B 超見孕囊者則診斷為臨床妊娠。

5.觀察指標：觀察低等級胚胎的囊胚形成率、優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、鮮胚周期臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率及宮外孕率，凍融周期囊胚移植的種植率、妊娠率、流產(chǎn)率及異位妊娠率。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗；計量資料采用（±s）表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、囊胚培養(yǎng)情況

患者年齡22～41歲，平均年齡（31.0±4.6）歲，共684個周期的3 536枚胚胎進行囊胚培養(yǎng)（平均每周期4～12 個胚胎），有475 個周期形成囊胚1 187個，囊胚形成率為33.6%，209個周期無囊胚形成。根據(jù)患者年齡將患者分為＞35歲組和≤35歲組，結(jié)果顯示＞35歲組囊胚形成率為21.9%，≤35歲組囊胚形成率為34.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。根據(jù)有無囊胚形成將患者分為有囊胚形成組與無囊胚形成組，比較兩組間平均年齡、獲卵數(shù)、基 礎FSH 值、Gn 天 數(shù)，Gn 用 量，HCG 日E2值，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。進一步將獲卵數(shù)分為≤10個組和＞10個組，結(jié)果顯示，≤10個組有囊胚形成周期比率為61.4%，無囊胚形成周期比率為38.6%；＞10個組有囊胚形成周期比率為79.2%，無囊胚形成周期比率為30.8%。比較兩組間受精方式與囊胚形成的關系，有囊胚形成組IVF周期比率為69.1%，ICSI周期比率為30.9%；無囊胚形成組IVF周期比率占46.2%，無囊胚形成組ICSI周期比率占53.8%。

二、鮮胚移植周期與囊胚形成率的關系

新鮮周期胚胎移植患者中，有囊胚形成組426個周期，無囊胚形成組187個周期，有囊胚形成鮮胚移植組受精率、臨床妊娠率、種植率顯著高于無囊胚形成組，流產(chǎn)率低于無囊胚形成組，兩組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

三、囊胚解凍復蘇后臨床妊娠情況

共122個周期鮮胚移植未妊娠患者進入凍融囊胚周期，共解凍低等級胚胎囊胚培養(yǎng)形成的囊胚220個，囊胚復蘇率為81.4%（179／220），共111個周期成功復蘇囊胚并移植。平均移植囊胚數(shù)為（1.6±0.2）個，囊胚移植周期臨床妊娠率（40.5%），種植率（27.4%），流產(chǎn)率（8.89%），與同期卵裂期胚胎凍融周期臨床妊娠率（43.0%）、種植率（24.0%）、流產(chǎn)率（7.8%）比 較，兩 組 間 差 異 無 統(tǒng) 計 學 意 義（P ＞0.05）；囊胚移植組復蘇率（81.4%）、異位妊娠率（8.9%）與同期卵裂期胚胎凍融周期復蘇率（94.4%）、異位妊娠率（3.7%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表3）。

四、凍融周期囊胚移植異位妊娠發(fā)生情況

111個凍融周期囊胚移植中45 個周期臨床妊娠，共有4例發(fā)生異位妊娠。其中，輸卵管妊娠3例，卵巢妊娠1例，移植囊胚均為優(yōu)質(zhì)囊胚（表4）。

表1 有囊胚形成組與無囊胚形成組一般情況的比較（±s）

表1 有囊胚形成組與無囊胚形成組一般情況的比較（±s）

組 別 例數(shù) 年齡（歲）不孕時間（年）獲卵數(shù)（個）bFSH（U／L）Gn用量（支）Gn天數(shù)（d）HCG 日E2 值（pmol／L）1.4 11.7±2.2 15 510.3±7 265.8無囊胚形成組 209 31.1±4.6 3.9±3.0 14.2±6.6 6.9±3.4 29.9±1有囊胚形成組 475 30.8±4.2 4.1±2.5 17.7±6.4 6.3±3.1 28.7±1 4.3 11.5±2.6 14 609.3±6 869.1

表2 有囊胚形成移植組與無囊胚形成移植組指標比較（n，%）

表3 凍融囊胚移植組與卵裂期胚胎移植組間妊娠情況比較

表4 囊胚移植后異位妊娠患者移植囊胚情況

討 論

胚胎形態(tài)學評分是目前最常用的胚胎評估方法［4］，卵裂期胚胎評分主要對卵裂球數(shù)目、細胞均勻程度以及碎片多少進行評估，具有無創(chuàng)、快速、簡便的優(yōu)點。臨床上對卵裂期胚胎形態(tài)學評分為低等級胚胎的處理尚無定論，目前多數(shù)學者建議可繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)進行篩選。盡管與優(yōu)質(zhì)胚胎相比，低等級胚胎囊胚形成率較低，但進一步延長體外培養(yǎng)時間可以讓其有更多自我選擇的機會［5］。如發(fā)生胚胎發(fā)育阻滯，可以及早取消避免無效移植。本研究共納入了3 536個D3形態(tài)學評分判定為低等級胚胎，獲得了33.6%的囊胚形成率，并在凍胚周期囊胚復蘇移植后獲得了40.5%的臨床妊娠率。本結(jié)果提示：胚胎的發(fā)育潛能并非與其形態(tài)完全一致，即使形態(tài)學評分為低等級的胚胎仍有獲得優(yōu)質(zhì)囊胚的可能，僅僅根據(jù)常規(guī)的卵裂期胚胎形態(tài)學評分來預測胚胎的發(fā)育潛能仍有相對的局限性。臨床上對剩余的低等級胚胎可延長體外培養(yǎng)時間培養(yǎng)至囊胚，篩選出具有發(fā)育潛能的胚胎并冷凍保存，從而可以最大限度地利用胚胎，增加患者妊娠機會。

回顧性分析鮮胚周期低等級胚胎囊胚形成影響因素中，我們發(fā)現(xiàn)＞35歲組囊胚形成率明顯低于≤35歲組，提示年齡是影響低等級胚胎囊胚形成的原因之一，年齡越大，胚胎發(fā)育潛能下降。此外，研究中比較無囊胚形成組與有囊胚形成組間獲卵數(shù)無統(tǒng)計學差異，但進一步將獲卵數(shù)分為≤10 個組和＞10個組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)≤10個組無囊胚形成周期比率明顯高于＞10個組，這一結(jié)果提示，對于獲卵數(shù)及胚胎數(shù)較少、且胚胎質(zhì)量不佳者，進一步行囊胚培養(yǎng)可能增加患者無胚胎移植風險。研究中比較受精方式與囊胚形成關系中發(fā)現(xiàn)，無囊胚形成組ICSI周期比率明顯高于無囊胚形成組，分析原因可能與男方精子質(zhì)量與胚胎發(fā)育潛能有一定的關系。

進一步分析鮮胚周期剩余低等級胚胎囊胚形成率與臨床妊娠率的關系時發(fā)現(xiàn)，剩余胚胎有囊胚形成周期的受精率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及種植率均顯著高于無囊胚形成周期，這與大部分文獻報道［6］結(jié)果一致。胚胎能否逾越8細胞阻滯期發(fā)育到囊胚，往往可間接預示著本周期其它胚胎的種植能力。本研究中有111個周期鮮胚移植后有囊胚形成而未妊娠者繼續(xù)行凍融周期囊胚移植，囊胚移植組臨床妊娠率、種植率及流產(chǎn)率與同期卵裂期胚胎移植周期比較無統(tǒng)計學差異。本結(jié)果還提示通過囊胚培養(yǎng)對低等級胚胎進行篩選，一旦形成囊胚并在凍融周期行囊胚移植可達到與卵裂期凍胚移植相似的妊娠率和種植率，最大程度地增加了患者累積妊娠率，從而改善輔助生殖助孕結(jié)局。

與自然妊娠相比，IVF 周期異位妊娠率提高了接近2.5～5倍。ART 中發(fā)生異位妊娠可能與輸卵管病變、子宮內(nèi)膜異位癥致盆腔微環(huán)境改變、移植管的置管深度、移植時的推注速度、植入胚胎的數(shù)目、移植的時機、胚胎在宮腔內(nèi)游走及胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育的同步性等因素有關［7-8］。有研究顯示，與D2移植比較，D3移植異位妊娠率有降低的趨勢，原因可能與隨著黃體期的延長，子宮收縮力降低有關。Fanchin等［9］研究發(fā)現(xiàn)，與HCG 當日比較，HCG 日后7d從宮底至宮頸的子宮收縮運動明顯減少。與卵裂期胚胎移植相比，囊胚期移植理論上更符合自然生理規(guī)律，更接近子宮內(nèi)膜的開窗期，且囊胚期卵巢黃體分泌孕酮更為旺盛，使得子宮壁及輸卵管運動收縮明顯減弱，加上囊胚體積較大，運動游走更為困難，以上因素均有利于減少異位妊娠的發(fā)生。然而，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)凍融周期囊胚移植組異位妊娠率高于卵裂期胚胎移植組，分析原因可能與樣本量尚小可能影響結(jié)果偏倚有關，我們將繼續(xù)擴大觀察樣本嚴密追蹤。此4例囊胚期移植宮外孕患者均移植的是優(yōu)質(zhì)囊胚，3例為輸卵管妊娠，另1例為較罕見的卵巢妊娠，此現(xiàn)象說明囊胚移植至宮腔后仍能發(fā)生遠處游走。近年關于囊胚期移植是否降低異位妊娠率仍有一定的爭論［10-11］，我們目前的數(shù)據(jù)尚無足夠的統(tǒng)計學證據(jù)表明囊胚移植可以降低異位妊娠的風險，我們認為，不應為避免異位妊娠而選擇囊胚移植。

綜上所述，我們認為，對胚胎質(zhì)量的評估手段依然需要不斷完善，對形態(tài)學評估為低等級的胚胎不應完全放棄，囊胚培養(yǎng)可幫助篩選出有發(fā)育潛能的胚胎，以增加胚胎的有效利用率和累計妊娠率。對于高齡、獲卵數(shù)少的患者，行低等級胚胎囊胚培養(yǎng)具有一定的風險，需謹慎。囊胚培養(yǎng)不能降低異位妊娠及流產(chǎn)的發(fā)生風險。盡管有學者對發(fā)育滯后的低等級胚胎持有應用安全性方面的疑問，比如囊胚培養(yǎng)延長體外培養(yǎng)時間，增加單卵雙胎率及影響胚胎的基因表達和表觀遺傳修飾等風險，但這些問題都有待于進一步研究探索。

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