蔡學泳，趙京卉，陳燕，刁瑞英＊

（1.深圳市第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學科，深圳 518035；2.山西省兒童醫(yī)院，太原 030013）

不孕癥是指以育齡期女子婚后或末次妊娠后，夫婦同居1年以上，男方生殖功能正常，未避孕而不受孕為主要表現(xiàn)的疾病?；楹?年以上從未受孕為原發(fā)性不孕；曾有過生育或流產(chǎn)史，又連續(xù)1年以上不孕，稱為繼發(fā)性不孕。不孕癥的發(fā)生率約占育齡婦女的8%～17%，平均10%左右［1］。除受精卵、輸卵管和精液等重要因素外，子宮因素如內(nèi)膜功能和代謝障礙在反復種植失敗和不明原因引起的不孕癥發(fā)生中也起到重要作用［2-3］。

線粒體是除細胞核以外唯一攜帶DNA 的細胞器，也是細胞能量產(chǎn)生的來源和場所。線粒體DNA（mtDNA）有37 個基因，編碼2 種rRNA 分子、22種tRNA 分子和13 種線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）復合體亞基；mtDNA 的蛋白質(zhì)編碼能力有限，只編碼細胞色素氧化酶Ⅰ-Ⅲ亞基、細胞色素酶b（Cyt b）、NADH 脫氫酶1-6（ND 1-6）和ND 4L 亞基以及ATP酶6和8亞基［4］。

參與編碼OXPHOS的mtDNA 組分出現(xiàn)問題，將會導致線粒體功能障礙，引起細胞代謝改變和能量生成下調(diào)，最后導致組織衰老、發(fā)育障礙或癌癥發(fā)生［5-6］。文獻報道，mtDNA 拷貝數(shù)與成熟卵母細胞的正常分裂密切相關，而采用微注射移植年輕供者的線粒體可以明顯改善卵母細胞的受孕成功率［7-8］。目前，有關不孕癥子宮內(nèi)膜細胞中mtDNA 缺失率，關注相對較少。因此，本研究擬探討不孕癥患者子宮內(nèi)膜細胞中的mtDNA 缺失率及能量變化，旨在探明子宮內(nèi)膜細胞mtDNA 缺失在不孕癥發(fā)生中的可能作用。

資料和方法

一、研究對象及分組

研究對象為2012年7月至2013年12月期間在深圳市第二人民醫(yī)院就診的不孕癥患者。

病例組的納入標準：原發(fā)性不孕組為育齡期婦女婚后有正常性生活，未經(jīng)避孕1年以上從未妊娠者；繼發(fā)性不孕組為曾有過妊娠而后未避孕1年以上不孕者。

病例組的排除標準：先天性生理缺陷或畸形、器質(zhì)性病變所致不孕；遺傳因素所致不孕；男方生殖功能異常；合并有心血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾??；精神病患者。

對照組的納入標準：月經(jīng)周期正常的育齡女性因男性因素就診者，病理檢查除外子宮內(nèi)膜病變。

常規(guī)檢查夫妻雙方肝功能，排除丈夫及第三者乙肝、丙肝、HIV、梅毒等傳染病。本研究獲得深圳市第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的批準，并經(jīng)每位受試者知情同意。

年齡是影響mtDNA 缺失的重要因素，因此各組進一步按年齡分為＜35歲和≥35歲組。其中，原發(fā)性不孕癥＜35歲和≥35歲組分別為14和16例，共30例；繼發(fā)性不孕癥＜35和≥35歲組分別為13和14例，共27例；對照組＜35和≥35歲組分別為12和14例，共26例。

二、子宮內(nèi)膜取材

黃體形成后，在孕激素作用下，子宮內(nèi)膜呈分泌反應，稱為分泌期。排卵后7～8d（相當于月經(jīng)周期第22天左右），黃體體積達最高峰。在子宮內(nèi)膜分泌期中期（又名黃體中期）即月經(jīng)周期第20～23天，進行子宮內(nèi)膜取材。此時，在卵巢分泌的黃體酮影響下，子宮內(nèi)膜維持高分泌活動和增厚狀態(tài)，恰與囊胚植入同步，可為受精卵種植和發(fā)育準備條件。取材體位為排尿后取膀胱截石位；常規(guī)消毒后，用陰道窺器暴露宮頸，以刮匙刮取子宮內(nèi)膜少許，將標本置-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

三、DNA 提取和巢式PCR

采用DNA 提取試劑盒（D3591-02，Omega，美國）提取子宮內(nèi)膜組織細胞中的DNA，進行巢式PCR 反應。表1 示巢式PCR 引物對的位置和序列［9］，圖1示引物在線粒體上的大體位置。

第一輪PCR 采用的引物對為H1＋L4，程序為：95℃5 min 變性；95℃40s，58℃40s，72℃6 min，35個循環(huán)；最后延伸72℃7min，保存在4℃。如存在mtDNA重排時，將PCR產(chǎn)物5μl作為模板，進行第二輪PCR，采用的引物對分別為H1＋L1、H3＋L2、H1＋L3、H1＋L2及H2＋L3，條件同第一輪。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳及測序分析。

表1 人mtDNA 片段缺失總體篩查引物

圖1 巢式PCR 引物在人mtDNA 上的大體位置

四、Real-time PCR檢測mtDNA 拷貝數(shù)

采用Real-time PCR方法檢測線粒體基因ND1及核基因HGB（cytoglobin，細胞球蛋白）含量，以ND1與HGB拷貝數(shù)的比值計算組織細胞中mtDNA 拷貝數(shù)的相對含量。采用SYBR Green master mix 試劑盒（Takara，大連），檢測儀器使用ABI PRISM 7500 熒 光 定 量PCR 儀（Applied Biosystems，美國），反應體系20μl。

引 物 序 列 為：（ND1-F）5′-CCCTAAAACCCGCCACATCT-3′ 和 （ND1-R）5′-GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT-3′；（HGB-F）5′-GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3′和（HGB-R）5′-CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3′。線粒體基因ND1的擴增條件是95℃10min，95℃15s，60℃1min，40個循環(huán)；核基因HGB 的擴增條件是95℃10 min，95℃15s，56℃1min，40個循環(huán)。

五、組織ATP（adenosine 5′-triphosphate）含量測定

各組取綠豆粒大小約20mg子宮內(nèi)膜組織（各組n＝10），加入200μl裂解液。勻漿裂解后4℃12 000 r／min離心5～10min，取上清用于后續(xù)的測定。

ATP檢測試劑盒（S0026，上海碧云天）的檢測原理是螢火蟲熒光素酶催化熒光素產(chǎn)生熒光時需要ATP提供能量。采用熒光分光光度計（Berthold LB 9501luminometer，德國）測算化學發(fā)光，制備標準曲線，并測算樣品中的ATP 濃度。本實驗每組重復3次。

六、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、不孕癥患者子宮內(nèi)膜細胞mtDNA 缺失率增加，且隨年齡增加而增多

對mtDNA 缺失的檢測采用表1中提供的引物對進行巢式PCR 擴增及測序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)mtDNA 存在多種片段類型的缺失，其中僅4 977bp缺失具有統(tǒng)計學意義。原發(fā)和繼發(fā)性不孕癥子宮內(nèi)膜細胞mtDNA 在這一區(qū)域的缺失率分別為86.67%（26／30）和78.78%（21／27），均 明 顯 高 于 對 照 組（38.46%）（P＜0.05）；原發(fā)和繼發(fā)性不孕兩組間比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（表2）。

進一步對各組內(nèi)按年齡分組的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)對照組≥35歲的mtDNA 4 977bp缺失率略高于＜35歲組，但可能由于樣本量有限，兩者并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；原發(fā)和繼發(fā)性不孕≥35歲組的mtDNA 4 977bp缺失率均顯著高于＜35歲組（P＜0.05），提示年齡因素對mtDNA 4 977bp缺失率的重要影響（表2）。

二、不孕癥患者子宮內(nèi)膜細胞中mtDNA 拷貝數(shù)增加，ATP含量下降

本研究采用Real-time PCR 檢測線粒體基因ND1與細胞核基因HGB 表達水平，以ND1／HGB比值來反映子宮內(nèi)膜細胞中mtDNA 拷貝數(shù)的變化。以對照組為基準進行統(tǒng)計，原發(fā)性不孕組子宮內(nèi)膜細胞mtDNA 拷貝數(shù)相對含量為（1.47±0.35），繼發(fā)性不孕組為（1.50±0.26），分別比對照組［（1.00±0.14）］高48.49%和51.01%（P＜0.01）（圖2A）。而不孕癥患者子宮內(nèi)膜細胞的ATP 含量則較對照組明顯下降，原發(fā)性不孕組子宮內(nèi)膜細胞ATP相對含量為（0.44±0.07），繼發(fā)性不孕組（0.39±0.06），分別比對照組［（1.00±0.19）］低57.00%和61.29%（P＜0.01）（圖2B）。

表2 線粒體mtDNA 4 977bp缺失頻率分析［n（%）］

圖2 子宮內(nèi)膜細胞mtDNA 拷貝數(shù)（A）和ATP相對含量檢測（B）

討 論

人mtDNA 上任何基因的突變，都可能影響線粒體OXPHOS的功能，參與細胞分化、細胞衰老、神經(jīng)退行性變、家族性耳聾、腫瘤的發(fā)生和進展［10］。卵巢功能低下（POI）、卵巢早衰（POF）及子宮內(nèi)膜異位癥患者都存在mtDNA 缺失率增加［11-12］。對于為受精卵種植和胚胎發(fā)育提供場所和能量的子宮內(nèi)膜，在黃體中期時受黃體酮影響維持其高營養(yǎng)、高能量的狀態(tài)。因此，從子宮內(nèi)膜mtDNA 缺失角度探尋不孕癥發(fā)生的機理，將有較好的臨床指導意義。

隨著年齡增加，自由基增多引起DNA 突變、蛋白損傷和端?？s短，細胞氧化呼吸能力下降，導致線粒體內(nèi)活性氧增加；廣泛的氧化應激損傷，進而引發(fā)線粒體內(nèi)細胞色素C 和凋亡啟動因子的釋放［13-14］。有研究證實，高齡女性卵母細胞mtDNA 4 977bp的突變率顯著高于年輕者［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，不孕癥組mtDNA 缺失率較對照組顯著增高。其中，mtDNA 4 977bp缺失最常見，其位于H1（np 8285-8304）＋L1（np13650-13631）引 物 對 即np 8304-13631之間。此外，因為年齡是影響mtDNA 缺失及功能的關鍵因素，本研究進一步以35歲為界將對照組、原發(fā)性不孕組和繼發(fā)性不孕組各分成兩個亞組，研究發(fā)現(xiàn)≥35歲組別中，原發(fā)性不孕（16 例）和繼發(fā)性不孕患者（14例）均存在mtDNA 4 977bp的缺失，且隨著年齡增加，不孕癥患者子宮內(nèi)膜4 977 bp缺失的發(fā)生率顯著增加?，F(xiàn)在許多尋求輔助生殖技術助孕的婦女年齡相對偏大，因此往往存在一定程度的線粒體功能改變。Seifer等［16］發(fā)現(xiàn)來自年齡大于38歲婦女的顆粒細胞中存在高水平的mtDNA缺失。隨著年齡增加細胞內(nèi)的自由基活性增強，不孕癥患者子宮內(nèi)膜中mtDNA 4 977bp缺失率增加，可能參與不孕癥發(fā)生。

過量氧化應激（OS）的存在，導致mtDNA 缺失率 增 加，mtDNA 拷 貝 數(shù) 增 多［17］。因 此，過 多 的mtDNA 拷貝數(shù)可能由于過量OS 壓力和OS 清除障礙，進而參與疾病或癌癥發(fā)生［18］。如在子宮內(nèi)膜癌中，mtDNA 拷貝數(shù)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）顯著增加［19］。癌癥組織mtDNA 中，常見的編碼基因缺失突變有Cytb、ND2和ATPase 8［10］。人為地在正常人泌尿上皮SV-HUC-1細胞中過表達突變Cytb基因序列，將導致細胞內(nèi)mtDNA 拷貝數(shù)增加，并通過抑制細胞色素C 釋放進而抑制凋亡途徑［20］。因此，mtDNA 拷貝數(shù)越多，可能提示線粒體呼吸鏈障礙和線粒體異常。本研究采用mtDNA 編碼的ND1作為線粒體的標志，以核編碼的HGB 相對表達量作為細胞核的標志，采用Real-time PCR 檢測ND1／HGB比值作為mtDNA 拷貝數(shù)的衡量指標。結(jié)果證明，不孕癥組子宮內(nèi)膜細胞中mtDNA 拷貝數(shù)比正常生育組顯著增加。

細胞內(nèi)ATP 水平，是細胞內(nèi)能量水平的監(jiān)控指標，其含量下降提示線粒體的功能受損或下降。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，不孕癥組樣本中的ATP 含量顯著低于對照組。因為線粒體正常功能的發(fā)揮對受孕期間子宮內(nèi)膜穩(wěn)態(tài)非常關鍵［21］，因此mtDNA 缺失以及能量異常必將會影響到子宮內(nèi)膜正常能量代謝，進而干擾或抑制受精卵種植和繼續(xù)發(fā)育。

子宮內(nèi)膜若存在mtDNA 缺失和功能障礙，將導致內(nèi)膜細胞能量代謝異常，可能參與不孕癥的發(fā)生。OS介導的子宮內(nèi)膜損傷及能量產(chǎn)生障礙，亦可能參與不孕癥的發(fā)生發(fā)展。因此，提早檢測和關注子宮內(nèi)膜能量代謝情況，并早期進行藥物和物理干預或保護，將對受精卵成功著床及胚胎正常發(fā)育至關重要。

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