李偉，施文浩，李明昭，師娟子

（西北婦女兒童醫(yī)院，西安 710061）

1983年，世界首例凍融胚胎移植（FET）后成功妊娠［1］，在隨后的時(shí)間里，這項(xiàng)技術(shù)在世界范圍內(nèi)取得了飛速發(fā)展，現(xiàn)在已成為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。FET 不僅能夠增加促排周期的妊娠機(jī)會(huì)，避免胚胎浪費(fèi)，降低患者的治療費(fèi)用［2］；還能減少胚胎移植的數(shù)量，降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)［3］。現(xiàn)在也有文獻(xiàn)報(bào)道FET 的臨床妊娠率和種植率與新鮮周期相比并無(wú)明顯差異［4］，但FET 比新鮮胚胎移植的異位妊娠率低［5］。影響FET 成功的因素很多，其中復(fù)蘇后胚胎的質(zhì)量，及其進(jìn)一步發(fā)育的潛能尤為重要。本文通過對(duì)大樣本臨床資料的回顧性分析，探討玻璃化冷凍胚胎復(fù)蘇后卵裂球是否損傷，以及過夜培養(yǎng)后能否恢復(fù)分裂生長(zhǎng)對(duì)移植結(jié)局的影響。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究回顧性分析2010年1月至2012年2月的1 679個(gè)玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎移植周期。所有周期均為受精后72h玻璃化冷凍胚胎，所有胚胎解凍后均經(jīng)過夜培養(yǎng)。本研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到醫(yī)院倫理道德委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎復(fù)蘇后是否有卵裂球損傷分為兩組：A 組（無(wú)損傷組，n＝1 357）、B 組（有損傷組，n＝322）。根據(jù)過夜培養(yǎng)后胚胎卵裂球是否分裂生長(zhǎng)將A 組分為兩個(gè)亞組：AⅠ組（有生長(zhǎng)組，n＝1 170）、AⅡ組（無(wú)生長(zhǎng)組，n＝187）。根據(jù)胚胎卵裂球是否有融合將AⅠ組再分為：AⅠ-1 組（有融合組，n＝316）、AⅠ-2組（無(wú)融合組，n＝854）。當(dāng)胚胎卵裂球細(xì)胞形成致密連接，細(xì)胞邊界不明顯時(shí)為胚胎卵裂球融合。

2.胚胎質(zhì)量分級(jí)及冷凍胚胎選擇：按Peter卵裂期胚胎評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估第3天胚胎質(zhì)量［6］，選擇評(píng)級(jí)為Ⅰ-Ⅲ的胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍。

3.胚胎玻璃化冷凍方法：采用Vitrification試劑盒（Kitazato，日本）進(jìn)行玻璃化冷凍，冷凍液分為ES液和VS液，4℃保存。使用前在室溫（25℃）條件下平衡30min。將胚胎吸入ES液，室溫下放置約5min。胚胎卵裂球出現(xiàn)皺縮時(shí)再擴(kuò)張，待胚胎卵裂球擴(kuò)張至原體積的80%以上，將其放入VS液。然后胚胎放置于有患者信息的無(wú)菌載桿上，迅速投入液氮中。

4.FET 周期內(nèi)膜準(zhǔn)備：內(nèi)膜準(zhǔn)備分自然周期與人工周期兩種。自然周期：對(duì)于月經(jīng)規(guī)律、有自然排卵者在月經(jīng)第6～8 天開始B 超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育，確認(rèn)排卵時(shí)間。排卵后第2天下午進(jìn)行胚胎解凍，第3天上午進(jìn)行移植。人工周期：對(duì)于月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙的患者，在月經(jīng)第3～5天開始口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂，先靈，德國(guó)）2～4mg／d，5d后監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，并根據(jù)內(nèi)膜情況調(diào)整藥物劑量，可增量至6～8mg／d；當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8mm 時(shí)，加用黃體酮（浙江仙琚）肌肉注射20～60 mg／d，第4天下午進(jìn)行胚胎解凍，第5天上午行胚胎移植。

5.胚胎解凍：胚胎解凍于移植前1天的下午進(jìn)行。使用Vitrification試劑盒，解凍液分為TS液、DS液、WS1液和WS2液，4℃保存。使用前，TS液在37℃平衡30min，其他解凍液在室溫（25℃）條件下平衡30min。將冷凍載桿從液氮中取出，迅速將前端葉片浸入TS液，待胚胎脫落到TS液中（一般1min內(nèi)），將胚胎依次移入DS、WS1和WS2液，分別放置3min、5 min、5min后，轉(zhuǎn)入預(yù)平衡好的培養(yǎng)液中觀察，有≥50%細(xì)胞數(shù)目存活的胚胎記為復(fù)蘇，其余的丟棄。復(fù)蘇成功的胚胎隨后放入37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（18～20h）。

6.胚胎移植：采用B超引導(dǎo)下移植。移植時(shí)若移植內(nèi)管或外管出現(xiàn)肉眼可見的血液為移植出血。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用卡方（χ2）檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、基本情況

本研究納入的1 679個(gè)FET周期，均為胚胎解凍后、經(jīng)過夜培養(yǎng)后進(jìn)行移植。其中解凍后胚胎無(wú)卵裂球損傷組（A 組）1 357個(gè)周期，有卵裂球損傷組（B組）322個(gè)周期。A、B兩組患者的促排卵年齡、基礎(chǔ)FSH 值、原發(fā)性不孕比例、移植時(shí)子宮內(nèi)膜厚度、移植出血發(fā)生率、移植胚胎數(shù)等比較，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。A、B兩組的胚胎凍存時(shí)間比較，B組為7個(gè)月，高于A 組的6.1個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

二、復(fù)蘇后胚胎卵裂球是否損傷對(duì)妊娠結(jié)局的影響

A 組的種植率和臨床妊娠率分別為32.33%、54.09%，均明顯高于B 組（23.07%、40.37%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表2）。

三、復(fù)蘇后胚胎能否恢復(fù)分裂生長(zhǎng)對(duì)妊娠結(jié)局的影響

AⅠ、AⅡ兩組比較，AⅠ組的種植率（33.87%）和臨床妊娠率（56.50%）均顯著高于AⅡ組（分別為22.08%和39.04%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表3）。

四、卵裂球是否融合對(duì)妊娠結(jié)局的影響

AⅠ-1 組的種植率和臨床妊娠率分別為40.93%、64.87%，明顯高于AⅠ-2 組的31.31%、53.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表4）。

表1 A、B兩組患者的基本情況［（±s），%］

表1 A、B兩組患者的基本情況［（±s），%］

注：與B組比較，＊P＜0.05

組 別 周期數(shù) 促排年齡（歲） 基礎(chǔ)FSH（U／L）原發(fā)性不孕率A 組1 357 29.8±4.3 7.0±4.4 56.9 B組 322 29.7±4.1 6.8±2.0 58.4組 別 周期數(shù) 胚胎凍存時(shí)間（月） 移植時(shí)內(nèi)膜厚度（mm） 移植出血發(fā)生率 移植胚胎數(shù)（枚）A 組 1 357 6.1±4.2＊9.4±1.4 47.7 2.3±0.5 B組322 7.0±5.9 9.4±1.3 44.1 2.3±0.6

表2 復(fù)蘇后卵裂球是否損傷對(duì)妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

表3 卵裂球生長(zhǎng)情況對(duì)妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

表4 卵裂球融合對(duì)妊娠結(jié)局的影響［n（%）］

討 論

胚胎冷凍過程中，會(huì)形成冰晶損傷、冷休克、滲透性休克等冷凍損傷，這些損傷可能導(dǎo)致胚胎卵裂球的破壞，從而影響隨后的胚胎發(fā)育及著床。Houghton等［7］認(rèn)為損傷的卵裂球釋放的胞質(zhì)能夠影響細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)，從而降低胚胎活力。杜丹等［8］研究表明對(duì)于玻璃化凍融胚胎移植，卵裂球完整胚胎數(shù)小于2枚時(shí)其臨床妊娠率和胚胎種植率顯著降低。El-Toukhy等［9］研究發(fā)現(xiàn)解凍后無(wú)卵裂球損傷的胚胎和有卵裂球損傷的胚胎相比，移植后的臨床妊娠率（22.8%vs 13.5%）和種植率（17.3%vs 8.1%）差異顯著。也有研究表明胚胎凍融后，隨著卵裂球損傷的增多，臨床妊娠率顯著下降［10-11］。本研究中，凍融后無(wú)卵裂球損傷組（A 組）的種植率和臨床妊娠率分別為32.33%、54.09%，均高于有卵裂 球 損 傷 組（B 組）的23.07%、40.37%（P ＜0.01）。與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致，表明胚胎凍融后如果發(fā)生卵裂球損傷，會(huì)影響后續(xù)的胚胎種植與妊娠。此外Nagy等［12］研究發(fā)現(xiàn)，將凍融后損傷的卵裂球移除能夠顯著提高胚胎的種植率。但也有研究表明，解凍后卵裂球損傷率低于25%的胚胎與沒有卵裂球損傷的胚胎相比，其種植率并沒有顯著性差異。

本研究中無(wú)卵裂球損傷組（A 組）與有卵裂球損傷組（B組）的胚胎凍存時(shí)間有差異，B 組高于A組，其余基本參數(shù)沒有顯著性差異，提示隨著胚胎凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)增加復(fù)蘇后胚胎卵裂球損傷的發(fā)生，進(jìn)一步影響胚胎種植與妊娠。但最近也有研究認(rèn)為不管是卵裂期胚胎還是囊胚，凍存時(shí)間對(duì)其存活率、種植率都沒有影響［13-14］。這可能與胚胎冷凍保存所用的方法不同有關(guān)，Wirleitner等［13］及Liu等［14］使用封閉的保存方法，胚胎不直接接觸液氮，而本研究使用的是開放的保存系統(tǒng)，胚胎直接與液氮接觸。開放系統(tǒng)冷凍保存的胚胎，其凍存時(shí)間是否影響解凍復(fù)蘇后胚胎卵裂球的狀態(tài)有待于我們進(jìn)一步的研究探討。

對(duì)復(fù)蘇后無(wú)卵裂球損傷組（A 組）進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有卵裂球分裂生長(zhǎng)組（AⅠ組）的種植率和臨床妊娠率均高于無(wú)卵裂球分裂生長(zhǎng)組（AⅡ組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Joshi等［15］研究發(fā)現(xiàn)的解凍后卵裂球恢復(fù)分裂的胚胎有更高的臨床妊娠率結(jié)果一致，表明胚胎解凍后經(jīng)過夜培養(yǎng)，可通過胚胎的卵裂球能否恢復(fù)分裂生長(zhǎng)預(yù)測(cè)胚胎繼續(xù)發(fā)育的潛能。Laverge等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)蘇后培養(yǎng)24h而無(wú)卵裂球分裂生長(zhǎng)的胚胎，染色體異常率很高，只有20%的胚胎具有完全正常的二倍體，這可能就是其種植率低的原因。Sole等［11］研究認(rèn)為解凍后有兩個(gè)以上卵裂球恢復(fù)分裂或胚胎發(fā)生融合，是移植成功一個(gè)很好的預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究中AⅠ組的胚胎，根據(jù)有沒有卵裂球融合分為有融合組（AⅠ-1組）和無(wú)融合組（AⅠ-2組），發(fā)現(xiàn)有融合組的種植率和妊娠率分別為40.93%、64.87%，顯著高于無(wú)融合組的31.31%、53.40%，表明解凍復(fù)蘇后的胚胎，經(jīng)培養(yǎng)后若達(dá)到融合狀態(tài)可以預(yù)測(cè)較高的種植率和妊娠率，提示凍融后出現(xiàn)融合的胚胎臨床上是否可以考慮行單胚胎移植。

綜上所述，胚胎凍融后如果有卵裂球損傷會(huì)影響后續(xù)的胚胎種植和妊娠。凍融后的胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，是否能恢復(fù)分裂生長(zhǎng)甚至達(dá)到融合狀態(tài)，可用于評(píng)價(jià)胚胎的發(fā)育潛能，對(duì)凍融周期胚胎的選擇有一定的指導(dǎo)作用。對(duì)于培養(yǎng)后卵裂球有融合的胚胎，是否可以考慮行單胚胎移植需要進(jìn)一步的研究探討。

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