李妮妮,南葉飛,張洵立,唐璇
(西安石油大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 西安 710065)
阿霉素(ADM)是一種抗癌抗生素,其結(jié)構(gòu)中含有糖苷和蒽環(huán),廣泛用于治療腫瘤疾病。臨床研究表明,它對(duì)白血病、骨肉瘤、乳腺癌及小細(xì)胞肺癌具有很好的療效[1-3]。在這些相關(guān)研究和藥物質(zhì)量控制工作中,阿霉素檢測(cè)方法有高效液相色譜法、放射免疫法等[4-5],操作步驟復(fù)雜、價(jià)格昂貴。本文利用ADM 本身有天然熒光,采用熒光分光光度計(jì)建立直接熒光分析方法,檢測(cè)鹽酸阿霉素原料藥及其注射制劑的含量。
鹽酸阿霉素原料藥(>99.5%),工業(yè)品;注射用鹽酸阿霉素;去離子水。
F97 熒光分光光度計(jì);BSA224S 型分析天平。
鹽酸阿霉素80.0 mg,用蒸餾水溶解至100 mL容量瓶中,作為鹽酸阿霉素儲(chǔ)備液,其濃度為2.76×10-3mol/L。
取鹽酸阿霉素儲(chǔ)備液,加水稀釋?zhuān)渲撇煌瑵舛鹊娜芤?,用熒光分光光度?jì)測(cè)定阿霉素的熒光激發(fā)波長(zhǎng)和熒光發(fā)射波長(zhǎng)。儀器參數(shù)為:掃面速度1 000 nm/min,掃面間隔1.0 nm,激發(fā)帶寬10 nm,發(fā)射帶寬10 nm,增益設(shè)為中。
鹽酸阿霉素儲(chǔ)備液加水稀釋到6. 98 ×10-5mol/L,用硫酸調(diào)pH =6.3[6],測(cè)定熒光激發(fā)波長(zhǎng)和熒光發(fā)射波長(zhǎng),結(jié)果見(jiàn)圖1。
由圖1 可知,鹽酸阿霉素的最大激發(fā)波長(zhǎng)λex=469 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)λem=593 nm。
圖1 鹽酸阿霉素的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of doxorubicin hydrochloride
鹽酸阿霉素儲(chǔ)備液加水稀釋?zhuān)瑴y(cè)定熒光強(qiáng)度,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 鹽酸阿霉素濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系Table 1 The relationship of doxorubicin hydrochlorideconcentration and fluorescence intensity
由表1 可知,鹽酸阿霉素的濃度在6. 98 ×10-5mol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最大,只有在一定的濃度范圍內(nèi),鹽酸阿霉素的濃度與其熒光強(qiáng)度呈正相關(guān)的關(guān)系。故選擇藥物濃度低于6.98 ×10-5mol/L 的溶液進(jìn)行鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的研究。
鹽酸阿霉素儲(chǔ)備液加水稀釋成0.99 ×10-7,2.46 ×10-6,4.91 ×10-6,9.82 ×10-6,1.29 ×10-5,1.97 ×10-5mol/L 濃度的溶液,測(cè)定熒光值,鹽酸阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),見(jiàn)圖2。
圖2 鹽酸阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 The standard curre of doxorubicin hydrohloride
由圖2 可知,濃度在9. 90 × 10-8~1. 97 ×10-5mol/L范圍內(nèi)具有較好的線(xiàn)性關(guān)系,線(xiàn)性方程為y=12.124x+104.81,R2=0.994 5。
配制濃度9.82 ×10-10mol/L 的鹽酸阿霉素溶液,以二次蒸餾水作為空白對(duì)照,測(cè)定熒光強(qiáng)度,結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 鹽酸阿霉素的檢測(cè)限Table 2 The determination of detection limit of doxorubicin hydrochloride
由表2 可知,9.82 ×10-10mol/L 鹽酸阿霉素的熒光強(qiáng)度的平均值F =2.14,標(biāo)準(zhǔn)偏差S =0.032。
其檢測(cè)限[7]。
對(duì)9.82 ×10-5mol/L 鹽酸阿霉素溶液在不同時(shí)間內(nèi)進(jìn)行熒光檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 鹽酸阿霉素穩(wěn)定性Table 3 Doxorubicin hydrochloride stability
由表3 可知,不避光保存條件下,鹽酸阿霉素溶液熒光強(qiáng)度在1 h 內(nèi)略有下降,10 d 后明顯減弱,一個(gè)月后減弱了近1/2 多。避光保存時(shí),熒光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定,符合藥物含量檢測(cè)的要求。
對(duì)濃度分別為1.24 ×10-5,4.31 ×10-6,4.97 ×10-7mol/L 的阿霉素溶液測(cè)定熒光值,每組測(cè)5 次,取平均值,其平均回收率見(jiàn)表4。
表4 鹽酸阿霉素的回收率Table 4 The recovery rate detection of doxorubicinhydrochloride
2.7.1 制劑含量的檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)取鹽酸阿霉素制劑2.1,3.0,3.5 mg 分別置于50 mL 的容量瓶中,用蒸餾水溶解、定容,測(cè)定熒光值,平行5 次,扣除空白對(duì)照,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度、分別為8. 79 ×10-6,1.27 ×10-5,1.49 ×10-5mol/L,含藥率,結(jié)果見(jiàn)表5。
表5 阿霉素制劑的含藥量Table 5 The including the dosage of detection of ADM doxorubicin hydrochloride injection
2.7.2 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱(chēng)取鹽酸阿霉素注射劑6.5 mg,置100 mL 容量瓶中,用蒸餾水溶解、定容。稱(chēng)取阿霉素3.9 mg,用蒸餾水溶解在50 mL 的容量瓶中,其濃度為1.34 ×10-4mol/L。按低、中、高三個(gè)不同水平將其加入待測(cè)樣品溶液,測(cè)定加標(biāo)回收率,見(jiàn)表6。
分別量取10 mL 鹽酸阿霉素注射劑溶液,置于3 個(gè)50 mL 容量瓶中,分別加入0.5,1.0,1.5 mL。
濃度1.34 ×10-4mol/L 的阿霉素溶液,用蒸餾水定容,測(cè)其熒光強(qiáng)度,平行3 次,取平均值,然后計(jì)算回收率。
表6 鹽酸阿霉素的加標(biāo)回收率Table 6 Standard addition recovery rate test of doxorubicin hydrochloride
采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)鹽酸阿霉素的含量,在 鹽 酸 阿 霉 素 濃 度9. 90 × 10-8~1. 97 ×10-5mol/L,熒光強(qiáng)度和濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R 為0.994 5,回收率98.91% ~101.0%,注射用鹽酸阿霉素的含藥量12. 24%,加標(biāo)回收率100.32% ~102.19%。熒光分析法測(cè)定鹽酸阿霉素具有操作簡(jiǎn)單、精密度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn),能夠用于鹽酸阿霉素原料藥及其制劑的檢測(cè)。
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