孫全喜　王云云　王秀貞　唐月異　吳琪　張青云　曹廣英　王傳堂

摘要：黃曲霉毒素污染嚴重影響著花生食品安全。通過常規(guī)育種的方式培育抗黃曲霉花生新品種進展緩慢，效果也難如人意。HTGS（Host-Induoed Gene Silencing，寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默）技術(shù)是一種新興的RNA干擾技術(shù)，為培育抗病植物提供了可能。但該技術(shù)在花生上的應(yīng)用尚未見報道。為創(chuàng)造抗黃曲霉花生新品系，本研究利用該技術(shù)構(gòu)建了兩個黃曲霉漆酶基因（Lac1和Lac2）的HIGS載體，并試圖將其轉(zhuǎn)化到易感黃曲霉的花生品種粵油20中，獲得了轉(zhuǎn)Lac1基因的PCR陽性種子。根據(jù)HIGS的原理，黃曲霉侵染后，轉(zhuǎn)基因花生中產(chǎn)生的dsRNA將抑制黃曲霉漆酶基因表達，從而使轉(zhuǎn)基因花生對黃曲霉產(chǎn)生抗性?；谠撛?，下一步將對轉(zhuǎn)基因種子是否抗黃曲霉侵染進行鑒定。本研究為利用HTGS技術(shù)探索黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為培育抗黃曲霉花生品種提供了一條新思路。

關(guān)鍵詞：花生；黃曲霉；漆酶基因；寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（HIGS）；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S565.203.53

文獻標(biāo)識號：A

文章編號：1001-4942（2015）10-0008-05

花生是世界重要的油料作物和經(jīng)濟作物，特別在廣大發(fā)展中國家，是重要的食用蛋白源和食用植物油源。我國是世界花生生產(chǎn)和消費大國，也是花生貿(mào)易大國。然而，花生易受黃曲霉菌侵染而產(chǎn)生黃曲霉毒素，嚴重影響著花生的食品安全。

黃曲霉侵染花生時，會誘導(dǎo)花生產(chǎn)生抗病反應(yīng)，釋放植保素（Phytoalexins）。花生不同品種中植保素的積累被認為與抗病性有關(guān)?；ㄉ械闹脖Ｋ刂饕擒晤惢衔铮⊿tilbenoids），此類化合物大部分具有抗真菌活性。而黃曲霉漆酶（Laccase）能夠降解芪類化合物，漆酶活性高低與黃曲霉致病性強弱有直接關(guān)系。

漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于植物、高等真菌和一些細菌分泌物中。在高等植物中，漆酶主要與木質(zhì)素降解有關(guān)。另外一些研究認為漆酶還與病原真菌的致病性相關(guān)。單寧酸（Tannic acid）是一種植保素，Kim等認為，在板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）侵染過程中，漆酶的存在可以使致病菌對單寧酸的抗性提高，從而增強對該病原的易感性。此外，還有漆酶參與人類病原真菌致病性的研究報道。

RNA沉默（RNAi）是植物抵御病毒入侵的一種自然防御機制。植物RNAi信號不但可以在相鄰細胞間傳遞，而且可以通過維管束進行遠距離傳播，并且能夠跨越物種界限，由寄主傳遞給寄生的植物、線蟲、細菌、真菌或取食植物的昆蟲。通過在植物（寄主）中異源表達病原物或昆蟲（寄生物）目標(biāo)基因的dsRNA，可誘發(fā)RNAi特異沉默病原或昆蟲中目標(biāo)基因的表達。這種寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（Host-In-duced Gene Silencing，HIGS）為作物抗病育種提供了新思路。

為研究HIGS技術(shù)在花生抗黃曲霉中的應(yīng)用效果，培育出抗黃曲霉花生新品種，本研究以黃曲霉漆酶基因作為HIGS靶標(biāo)，構(gòu)建其RNAi載體，對感黃曲霉花生品種粵油20進行轉(zhuǎn)化，獲得了推斷轉(zhuǎn)化體。

1材料與方法

1.1試劑及材料

本研究所用花生材料為易感黃曲霉品種粵油20。大腸桿菌DH5α感受態(tài)、DNA分子量標(biāo)記、PCR Mix等購自北京全式金生物有限公司；限制性內(nèi)切酶均購自Fermentas公司；T4 DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；農(nóng)桿菌菌株EHA105以及RNAi載體pF-GC5941為本實驗室保存。

1.2DNA和氨基酸序列分析、DNA合成

DNA測序和DNA合成均由上海桑尼生物科技有限公司完成?；蜷_放閱讀框（ORF）由ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）獲得。氨基酸序列比對由DNAMAN序列分析軟件（LynnonBiosoft）完成。

1.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

2014年7月在萊西試驗站專門的轉(zhuǎn)基因試驗區(qū)按本項目組專利技術(shù)（專利號：ZL2011 10058531.2）對粵油20進行農(nóng)桿菌注射。10月收獲種子，晾干，保存。

1.4轉(zhuǎn)基因花生的PCR檢測

在花生種子遠離胚芽的一端切下薄薄的一層子葉組織，利用該部分組織提取DNA，提取方法參照國家發(fā)明專利“花生健康組織和病組織簡便快速DNA提取方法”（專利號：ZL 2009 10255786.0）。經(jīng)上述處理的花生種子可以進行正常種植。用基因特異引物（見表1）進行PCR擴增，篩選PCR陽性花生種子。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

2結(jié)果與分析

2.1黃曲霉漆酶基因片段的獲得

在NCBI上搜索到兩個可能的漆酶基因（XM_002373291和XM_002382249），長度分別為1764bp和1797bp，分別標(biāo)記為Lac1和Lac2。經(jīng)NCBI Blast分析，發(fā)現(xiàn)兩者都具有3個保守的銅原子結(jié)合位點。將Lac1和Lac2編碼的氨基酸與GenBank中登錄的蛋白序列進行比對后發(fā)現(xiàn)：這兩個基因與其它真菌漆酶基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性（圖1）。

分別選取Lac1（139-448）和Lac2（20-329）各310bp的序列（圖2），每個片段的5′端添加限制性內(nèi)切酶Xba I-Asc I識別序列，3′端添加Swa I-BamH I識別序列，以方便構(gòu)建RNAi載體。由上海桑尼生物科技有限公司進行全基因合成。片段合成后，亞克隆到克隆載體pUC57中，得到的載體分別命名為pUC57-Lac1和pUC57-Lac2。經(jīng)M13F引物測序，序列完全正確。endprint

2.2黃曲霉漆酶基因RNAi載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶Asc I和Swa I將Lac1和Lac2片段分別從pUC57-Lac1（圖3B，以Lac1為例，下同）和pUC57-Lac2切下，連接到同樣經(jīng)過Asc I和Swa I酶切的植物RNAi載體pFGC5941（圖3A，載體信息見http：//www.snapgene.com/resources/plasmid_files/plant_vectors/pFGC5941/）。經(jīng)特異引物（見表1）篩選，得到含目的片段的質(zhì)粒pF-GC5941-Lac1-1（圖4A）和pFGC5941-Lac2-1。

質(zhì)粒pUC57-Lac1和pUC57-Lac2經(jīng)BamH I和Xba I酶切（圖3D），得到的片段連接到經(jīng)BamH I和Xba I酶切的pFGC5941-Lac1-1（圖3C）和pFGC5941-Lac2-1中，經(jīng)PCR篩選，得到帶有第二個片段的質(zhì)粒pFGC5941-Lac1-2（圖4B）和pFGC5941-Lac2-2。此時，載體中均包含一個正向目的片段和反向目的片段及中間由ChsA intron間隔的結(jié)構(gòu)。

2.3轉(zhuǎn)基因花生T₀代種子的PCR檢測

將構(gòu)建好的質(zhì)粒pFGC5941-Lac1-2轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，利用本課題組發(fā)明的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法對易感黃曲霉品種粵油20進行遺傳轉(zhuǎn)化，收獲了轉(zhuǎn)Lac1基因的花生種子29粒；提取DNA后，利用Lac1特異引物（見表1）進行PCR篩選。結(jié)果篩選到轉(zhuǎn)Lac1的PCR陽性花生種子11粒，轉(zhuǎn)化率達38%。圖5僅顯示部分結(jié)果，其中2～5號和7號樣品有目的條帶，N為陰性對照，P為陽性對照。目前，這些PCR陽性花生種子已種于轉(zhuǎn)基因隔離區(qū)，所結(jié)種子將用于黃曲霉抗性鑒定。

3討論與結(jié)論

國內(nèi)外長期以來通過常規(guī)手段培育抗黃曲霉花生品種，周期長、進展緩慢且效果不甚理想?；蚬こ碳夹g(shù)有望解決花生黃曲霉毒素污染問題。寄主誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因沉默（HIGS）技術(shù)是一種研究病原物（真菌等）基因功能以及控制病原物造成其寄主病害的全新技術(shù)。該技術(shù)將構(gòu)建的含病原物目的基因片段發(fā)夾結(jié)構(gòu)的載體轉(zhuǎn)化到寄主中，從而導(dǎo)致病原物特定基因序列雙鏈RNA（dsRNA）表達；當(dāng)病原物侵染表達了dsRNA的寄主時，dsRNA由寄主傳遞給病原物，對病原菌內(nèi)源特定基因的表達進行RNA干擾，從而引起病原菌特定基因表達的下調(diào)。該技術(shù)為花生抗黃曲霉育種提供了新思路，但目前尚未見有利用HIGS技術(shù)增強花生對黃曲霉抗性的研究報道。

黃曲霉漆酶活性高低被認為與黃曲霉致病性強弱有直接關(guān)系。為了抑制黃曲霉漆酶基因Lac1和Lac2的表達，本研究以黃曲霉兩個漆酶基因為HIGS的靶標(biāo)，構(gòu)建其RNAi載體，并對感黃曲霉花生品種粵油20進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，初步獲得了轉(zhuǎn)Lac1的PCR陽性花生種子。從圖5中可以看出，PCR陽性樣品目的條帶較弱，可能與提取的DNA質(zhì)量較差有關(guān)?；ㄉN子中油分含量較高，DNA較難提取，其提取質(zhì)量與操作者的不熟練程度密切相關(guān)。

為進一步研究轉(zhuǎn)黃曲霉漆酶基因的花生是否抗黃曲霉，本課題組已將PCR陽性轉(zhuǎn)Lac1花生推斷轉(zhuǎn)化體種子種植于轉(zhuǎn)基因試驗區(qū)，待收獲種子后將進行黃曲霉侵染鑒定，檢測其是否獲得了黃曲霉抗性。同時，將繼續(xù)用含Lac2的RNAi載體對粵油20進行遺傳轉(zhuǎn)化，以期獲得抑制Lac2表達的轉(zhuǎn)基因花生。

本研究為利用HIGS技術(shù)探討黃曲霉漆酶基因與黃曲霉致病性的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，為培育抗黃曲霉花生新品種提供了一條新的思路。endprint