王西祥+丁延芹+杜秉海+姚良同+祁國振+葛科+劉凱

摘要：應(yīng)用單因素設(shè)計(jì)法對影響內(nèi)生枯草芽孢桿菌NS178發(fā)酵液菌落數(shù)的因子進(jìn)行篩選，得到3個(gè)主要影響因子，分別為葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4。采用Box-BehnkenDesign法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，通過響應(yīng)面法分析獲得最佳配方為葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。對溫度、初始pH值、裝液量3組培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳條件為33℃、pH7.6、50mL。在最佳配方和培養(yǎng)條件下，NS178發(fā)酵液菌溶數(shù)為34.50×108cfu/mL；培養(yǎng)72h時(shí)芽孢率達(dá)到75.8%；優(yōu)化后比優(yōu)化前發(fā)酵液抑菌圈直徑增加67%。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；芽孢；響應(yīng)面；抑菌圈

中圖分類號：S144文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）04-0059-07

微生物肥料又稱菌肥或生物肥料，是一類以微生物生命活動(dòng)及其代謝產(chǎn)物使農(nóng)作物得到特定有益肥料效應(yīng)的微生物活體制品[1]。微生物肥料在培肥地力，保護(hù)環(huán)境，抑制農(nóng)作物對硝態(tài)氮、重金屬、農(nóng)約的吸收，凈化和修復(fù)土壤，促進(jìn)農(nóng)作物秸稈和城市垃圾的腐熟利用以提高生物質(zhì)利用率、降低農(nóng)作物病害發(fā)生，以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全等方面已表現(xiàn)出不可替代的作用[2]，符合環(huán)境保護(hù)、食品安全和人類健康的需要[5]。微生物肥料的施用能夠調(diào)節(jié)土壤微生物生態(tài)，使其向著健康方向發(fā)展[4]，促進(jìn)植株吸收營養(yǎng)元素，產(chǎn)生抗生素等多種物質(zhì)抑制細(xì)菌或真菌性病害，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性間接促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)植物抗逆性，提高宿主的抗性和減緩pH值變化等能力[3]。

收稿日期：2014-12-18

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（200903018）

芽孢桿菌（Bacillussp.）在自然界廣泛存在，其抑菌物質(zhì)復(fù)雜多樣，具有較廣抑菌譜[6]。研究芽孢桿菌對植物病害的防治作用，對于開發(fā)微生物菌劑有著十分重要的意義。枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis）是目前研究最為熱門的抑菌微生物，不僅在防治多種植物病害方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，而且還能促進(jìn)作物生長、增加產(chǎn)量、增強(qiáng)植物抗逆性等，國內(nèi)外均有產(chǎn)品登記注冊[7，8]。B.subtilis168作為第一株全基因組測序完成的革蘭氏陽性菌，具有生物安全性，為研究細(xì)胞分化的模式微生物[9]。枯草芽孢桿菌所產(chǎn)芽孢耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑等，在工業(yè)機(jī)械化生產(chǎn)及高溫干燥過程中，可以保讓微生物菌劑的活性，提高其產(chǎn)品質(zhì)量[10]。不同枯草芽孢桿菌在抑菌譜、抑菌效果及抑菌機(jī)制等方面有較大差異，因此篩選出存活率高、繁殖速度快且具有較強(qiáng)抗菌能力的枯草芽孢桿菌仍是目前研究的重點(diǎn)[11]。

生物菌劑的制備過程中存在發(fā)酵菌落數(shù)偏低、芽孢生成率較低的問題，且優(yōu)化培養(yǎng)基組成是一個(gè)長期復(fù)雜的過程，涉及大量的數(shù)據(jù)分析處理。響應(yīng)面法（responsesurfacemethodology，RSM）克服了傳統(tǒng)的單因素試驗(yàn)次數(shù)多、試驗(yàn)周期長和結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，已被成功應(yīng)用于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[12]。本文采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對影響枯草芽孢桿菌NS178發(fā)酵液菌落數(shù)的相關(guān)組分進(jìn)行初步優(yōu)化，通過Box-Behnken（B-B）設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化了發(fā)酵配方，確定了最優(yōu)培養(yǎng)條件，以期為枯草芽孢桿菌肥料的開發(fā)提供可靠的理論依據(jù)，為工業(yè)生產(chǎn)生物菌肥提供參考。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌：枯草芽孢桿菌（Bacillussubtillis）NS178，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

指示菌：生姜莖腐病原菌（Pythiumsp.），由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2供試培養(yǎng)基

菌種活化培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（豆芽汁培養(yǎng)基）：黃豆芽200g，蔗糖20g，蒸餾水1000mL。

抑菌物質(zhì)生測培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯100g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。

1.3菌種種子液的制備

將斜面保存的供試菌NS178接種到LB平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。接種環(huán)挑取一環(huán)接種到裝有液體LB培養(yǎng)基的試管中，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)，分光光度計(jì)法測定不同時(shí)期菌液的OD600值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此確定適宜種齡進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4最優(yōu)培養(yǎng)基影響因素的獲取

選取碳源、無機(jī)氮源、無機(jī)鹽共12個(gè)因素做單因素試驗(yàn)，每因素設(shè)計(jì)4個(gè)水平，詳見表1。以豆芽汁培養(yǎng)基（黃豆芽100g，蔗糖20g，水1L）為對照。重復(fù)4個(gè)。菌種種子液的接種量為2%（體積比），31℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h先確定最佳碳源及其水平，在此基礎(chǔ)上，確定最佳無機(jī)氮源及水平，最后確定最佳無機(jī)鹽及水平。單因素試驗(yàn)均用活菌計(jì)數(shù)法測定的菌落數(shù)為指標(biāo)，確定最優(yōu)培養(yǎng)基的影響因素。

1.5最佳培養(yǎng)基的確定

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，Box-Behnken模型以葡萄糖（x1）、（NH4）2SO4（x2）和K2HPO4（x3）濃度為自變量，以菌落數(shù)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)擬合自變量與響應(yīng)值之問的函數(shù)關(guān)系。按下面公式進(jìn)行編碼轉(zhuǎn)換：

X1=（x1-2）/1；X2=（X2-0.3）/0.2；X3=（x3-0.2）/0.1式中：X1、X2、X3為不同試驗(yàn)因素的編號，見表2。

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析均為Design-Expert7.0軟件提供。

將初始培養(yǎng)基和預(yù)測的最佳培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性，重復(fù)3次。

1.6培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在獲得最佳培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)6組初始pH值：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，進(jìn)行初始pH值對菌落數(shù)的影響試驗(yàn)；在250mL三角瓶中分別加入50、75、100、150mL液體培養(yǎng)基，進(jìn)行需氧量試驗(yàn)；將培養(yǎng)溫度調(diào)節(jié)為28、31、33、35、37℃，進(jìn)行培養(yǎng)溫度對菌落數(shù)的影響試驗(yàn)。培養(yǎng)條件優(yōu)化菌落數(shù)以活菌計(jì)數(shù)法測定。endprint

1.7最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)

1.7.1菌落數(shù)的測定（活菌計(jì)數(shù)法）無菌條件下將發(fā)酵液稀釋至10-6、10-7、10-8，吸取200μL于無菌平板中，每個(gè)梯度重復(fù)3次。倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20h后取出計(jì)數(shù)。

1.7.2芽孢率的測定將菌液培養(yǎng)24h后，每隔12h測定一次芽孢數(shù)。芽孢率的測定方法為：80℃水浴加熱15min后，用稀釋涂布法檢測芽孢生成量[13]。

1.7.3抑菌物質(zhì)效價(jià)的測定指示菌菌懸液的制備：將活化的生姜莖腐病病原菌涂布于PDA平板上，28℃培養(yǎng)4d。刮取一環(huán)菌絲體置于5mL無菌水中，振蕩均勻，制成菌懸液。

生測平板的制備：將5mLPDA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，凝固后，用鑷子夾取一個(gè)牛津杯置于培養(yǎng)皿中央。PDA培養(yǎng)基冷卻至50～60℃，加入1mL指示菌菌懸液，混勻后倒入培養(yǎng)皿上層，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d。

效價(jià)的測定：采用牛津杯法[14]。發(fā)酵液10000r/min離心5min后，取上清液加入牛津杯中（50μL/孔），28℃培養(yǎng)4d，十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑計(jì)算其效價(jià)。

2結(jié)果與分析

2.1NS178生長曲線

根據(jù)不同時(shí)期測定的OD600值繪制生長曲線，如圖1所示。接種時(shí)菌液OD600值為0.150；培養(yǎng)12h時(shí)OD600值為0.623；培養(yǎng)24h時(shí)OD600值為2.013，此段時(shí)間生物量快速增長，菌落數(shù)較12h時(shí)增加14倍，為對數(shù)期；24～36h時(shí)，菌落數(shù)保持不變，為穩(wěn)定期。因此，選擇對數(shù)中后期（即20h）的菌作為菌種，進(jìn)行培養(yǎng)基組成的優(yōu)化。

2.2最優(yōu)培養(yǎng)基影響因素

根據(jù)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，活菌計(jì)數(shù)法測定菌落數(shù)，不同物質(zhì)及其水平對應(yīng)的結(jié)果見表3。篩選的最優(yōu)影響因素是葡萄糖、（NH4）2SO4和K2HPO4。

2.3最佳培養(yǎng)基

根據(jù)Box-Behnkon試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，獲得17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的菌落數(shù)如表4。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可以分為2類：其一為析因點(diǎn)，自變量在X1、X2、X3組成的三維頂點(diǎn)，總計(jì)12個(gè)析因點(diǎn)；其二為零點(diǎn)，即區(qū)域中心點(diǎn)，中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。

用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸方法擬合，獲得響應(yīng)值與自變量關(guān)系的二次多項(xiàng)式：

式（1）中：Y為預(yù)測響應(yīng)值即發(fā)酵液菌落數(shù)，方差分析見表5。

由表5可知，所選模型的不同處理間差異極顯著，說明回歸方程描述應(yīng)變量與自變量之間的線性關(guān)系顯著，試驗(yàn)方法真實(shí)可靠。X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X12、X22、X32的P值均小于0.05，說明這些因素對模型顯著。失擬項(xiàng)0.56>0.05，失擬項(xiàng)差異不顯著，說明該方程對試驗(yàn)擬合性較好，試驗(yàn)誤差小。該模型的R2=0.9931，=0.9843，自變量和響應(yīng)值之間線性關(guān)系達(dá)到顯著水平，因此可以利用該回歸方程確定最佳發(fā)酵條件[15]。

根據(jù)上述回歸方程及回歸模型方程分析表繪出雙因子效應(yīng)分析圖和相應(yīng)等高圖（見圖2、圖3和圖4），可知，當(dāng)K2HPO4濃度不變時(shí)，菌落數(shù)隨著葡萄糖和（NH4）2SO4濃度的增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢.且葡萄糖增加速度較快；當(dāng)（NH4）2SO4濃度不變時(shí)，菌落數(shù)量隨K2HPO4濃度的增大呈緩慢增加趨勢，葡萄糖增加速度較快，且呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；當(dāng)葡萄糖濃度不變時(shí)，隨著（NH4）2SO4和K2HPO4濃度的增高，菌落數(shù)呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，過高濃度的（NH4）2SO4和K2HPO4均不利于菌體的生長。

將式（1）分別對各自量（X1、X2、X3）求一階偏導(dǎo)數(shù)并均令其為0，即可得到一個(gè)三元一次線性方程組，解此方程組得到模型預(yù)測最佳點(diǎn)為：葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%，代入回歸方程，得到理論菌落數(shù)Y=32.50×108cfu/mL。

2.4模型的驗(yàn)證結(jié)果

由6可知，驗(yàn)證平均值與預(yù)測值相吻合，證實(shí)了模型的準(zhǔn)確性。響應(yīng)面法獲得最佳培養(yǎng)條件是可行的，菌落數(shù)可以真實(shí)反映3個(gè)影響因素對菌落數(shù)的影響。優(yōu)化后發(fā)酵液菌落數(shù)為33.12×108cfu/mL，較優(yōu)化前提高5.83倍。

根據(jù)《中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—微生物肥料》（NY227-94）的規(guī)定，用于微生物肥料的液體成品指標(biāo)中，有效活菌落數(shù)為5×108～10×108cfu/mL，雜菌落數(shù)<5%。優(yōu)化后發(fā)酵液菌落數(shù)滿是微生物肥料的要求，適用于有益微生物制成的、能改善作物營養(yǎng)條件的活體微生物肥料制品。

2.5最佳培養(yǎng)條件

測定6個(gè)初始pH值對菌落數(shù)的影響（圖5），發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.0～7.5時(shí)與菌落數(shù)呈正相關(guān)，7.5～8.5時(shí)呈負(fù)相關(guān)；枯草芽孢桿菌NS178的最適宜初始pH值為7.5，細(xì)菌總數(shù)為31×108cfu/mL。過高或過低都不利于菌體增殖，

250mL三角瓶的裝液量為50、75、100、150mL所得活菌落數(shù)如圖6所示，菌落數(shù)隨著裝液量的增加而逐漸減少，以每瓶裝液量50mL產(chǎn)量最高，說明該菌株為好氧菌，發(fā)酵過程中要求較好的通氣條件。雖然沒有設(shè)置裝液量低于50mL試驗(yàn)，但是250mL三角瓶內(nèi)裝液量過少可能由于過度蒸發(fā)而改變培養(yǎng)基各組分的濃度，產(chǎn)生較大的試驗(yàn)偏差，也會(huì)因發(fā)酵液體積過少而導(dǎo)致發(fā)酵規(guī)模的縮小，實(shí)際意義不大，因此選擇50mL作為最佳裝液量，此時(shí)菌落數(shù)為33×108cfu/mL。

圖7顯示，33℃以下溫度不利于菌體增殖，當(dāng)溫度為33℃，菌落數(shù)達(dá)到最大值，為34.5×108cfu/mL，此后隨溫度升高呈下降趨勢。

2.6最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對茵落數(shù)和芽孢率的影響

優(yōu)化培養(yǎng)條件后，24h菌落數(shù)為34.50×108cfu/mL，為優(yōu)化前近7倍；72h時(shí)芽孢數(shù)為26.75×108cfu/mL，芽孢率達(dá)到75.8%，結(jié)果如圖8。endprint

2.7最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下發(fā)酵液的抑菌效果

優(yōu)化前發(fā)酵液的抑菌圈直徑為12.56mm，優(yōu)化后發(fā)酵液的抑菌圈直徑為20.93mm。優(yōu)化后較優(yōu)化前增加67%，優(yōu)化后的發(fā)酵液能產(chǎn)生更多抑菌物質(zhì)，拮抗效果如圖9所示。

3討論

本試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)從影響菌落數(shù)的12個(gè)因素中，確定葡萄糖、（NH4）2SO4、K2HPO4為最重要的影響因素。為了合理簡便地尋找響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)，進(jìn)一步采用Box-BehnkenDesign響應(yīng)面法分析，得出回歸模型最優(yōu)組合為葡萄糖2.29%、（NH4）2SO40.3%、K2HPO40.23%。模型預(yù)測的最大菌體濃度為32.50×108cfu/mL，驗(yàn)證值為33.12×108cfu/mL，與預(yù)測值相差1.91%。實(shí)測值和預(yù)測值之間較好的吻合性顯示了所建模型的精確性和可靠性。

本試驗(yàn)還通過搖瓶發(fā)酵研究了初始pH值、溶氧水平以及溫度對枯草芽孢桿菌菌落數(shù)形成的影響。初始pH值對菌落數(shù)的生成有很大影響，在初始pH為7.5時(shí)，菌落數(shù)最多，過酸或過堿都不利于菌落形成。溶氧水平試驗(yàn)中，菌落數(shù)隨著裝液量增加而降低，最佳裝液量為50mL，隨著液體體積的增加，細(xì)菌供氧不足，不利于好氧菌株NS178菌落數(shù)的增加。趙達(dá)等[16]利用單因素篩選和均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌B03液體發(fā)酵條件為：500mL三角瓶裝液量50mL，初始pH值6.0，發(fā)酵溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵周期60～66h，與本試驗(yàn)結(jié)論基本相符。

芽孢并不是細(xì)菌生活史中不可缺少的部分，只是產(chǎn)芽孢細(xì)菌在生長過程中形成的一種抗逆性休眠體，它的形成受很多因素的影響，包括營養(yǎng)物質(zhì)、環(huán)境因素等[18]。芽孢形成是一個(gè)受基因控制的極其復(fù)雜的過程，已發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌至少有50個(gè)基因與芽孢形成有關(guān)，大致分布在染色體的5個(gè)區(qū)段中，按照一定的方向和順序表達(dá)，分別控制芽孢形成過程的不同階段。2，6-吡啶二羥酸（DPA）是芽孢的特有成分，在母細(xì)胞中與Ca2+結(jié)合形成Ca2+-DPA復(fù)合物，在降低芽孢核含水量和增強(qiáng)芽孢耐熱性上起著重要作用[19]。豆芽汁培養(yǎng)基可以為芽孢的形成提供大量的Ca2+，促進(jìn)芽孢形成。K+能促進(jìn)B.megaterium、B.cereus形成芽孢[20]。從表7的對比結(jié)果可知，本試驗(yàn)獲得的芽孢數(shù)、芽孢生成率和容積生產(chǎn)率明顯高于國內(nèi)外水平。

在同一培養(yǎng)基中，菌株生長量與其抑菌物質(zhì)分泌呈正相關(guān)，菌株抑菌物質(zhì)是在菌株生長過程中分泌的代謝產(chǎn)物，內(nèi)生拮抗細(xì)菌BS-2對植物病害的防治作用是由菌體在植物體內(nèi)的內(nèi)生定殖和分泌抑菌物質(zhì)共同作用的結(jié)果[2]。生防菌分泌的抑菌物質(zhì)種類多樣，濃度高低和代謝條件也不盡相同。劉雪等[2]研究發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)，可以抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，并使部分孢子萌發(fā)畸形。盧彩鴿等[23]發(fā)現(xiàn)利迪鏈霉菌A01活性代謝產(chǎn)物那他霉素對甘藍(lán)枯萎病菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均有明顯的抑制活性，通過增加膜的通透性引起菌絲細(xì)胞的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的病變。

本試驗(yàn)對枯草芽孢桿菌NS178的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵的初步探究。為了獲得更多可靠的數(shù)據(jù)，需要進(jìn)一步研究NS178對指示菌的拮抗機(jī)制，并研究發(fā)酵罐中芽孢形成的最適宜條件，為大型工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。endprint