崔彩紅+房偉強(qiáng)+李興鋒+王洪剛+鮑印廣

摘 要：源于長穗偃麥草的抗病基因Sr25、Sr26對(duì)稈銹病強(qiáng)毒力小種Ug99及其變種具有良好抗性，本實(shí)驗(yàn)室前期在長穗偃麥草與普通小麥雜交后代中選育出兩個(gè)攜帶Sr25、Sr26基因的八倍體小偃麥。本研究選用濟(jì)麥22、泰農(nóng)18、山農(nóng)637等小麥品種（系）分別與兩個(gè)八倍體小偃麥雜交、同交，利用與Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，定向培育出9個(gè)含有Sr25或（和）Sr26的小麥新種質(zhì)。這些新種質(zhì)綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，可以作為抗病新種質(zhì)用于小麥抗病育種，以應(yīng)對(duì)Ug99威脅。

關(guān)鍵詞：小麥；稈銹??；Sr25；Sr26；分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號(hào)：S512.103.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）04-0013-05

小麥稈銹病是由禾柄銹菌小麥專化型（Puccinia graminis f. sp. tritici）引起的一類真菌性病害，可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)75%，甚至絕產(chǎn)。自20世紀(jì)70年代開始，各國小麥育種工作者與病理學(xué)家共同努力，不斷發(fā)掘新的抗性基因，特別是源于黑麥1R染色體的Sr31基因的廣泛應(yīng)用，使稈銹病得到了有效控制[2]。然而，1999年烏干達(dá)發(fā)現(xiàn)了致病力極強(qiáng)的新型稈銹病小種Ug99，它不但克服了Sr31的抗性，而且其變異菌株使得Sr24、Sr28、Sr29、Sr33、Sr36、Sr38等基因也喪失了抗性[3～7]。2006年，在肯尼亞鑒定的我國118份主栽小麥品種中，只有山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育成的濟(jì)麥20表現(xiàn)高抗，這說明Ug99一旦傳入中國，由于現(xiàn)有品種抗性普遍較差，很有可能對(duì)我國小麥生產(chǎn)帶來災(zāi)難性危害[8，9]。

收稿日期：2015-03-10

基金項(xiàng)目：山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目（J11LC25）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目“農(nóng)業(yè)生物資源創(chuàng)新利用研究”

研究表明，源于長穗偃麥草（Thinopyrum ponticum）的抗稈銹病基因Sr25、Sr26對(duì)Ug99及其變異菌株具有良好抗性[10]。目前，已有學(xué)者開發(fā)了與Sr25[10，11]、Sr26[10，12]緊密連鎖的分子標(biāo)記，為進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種提供了便利。本實(shí)驗(yàn)室在普通小麥與長穗偃麥草的雜交后代中，選育出兩個(gè)八倍體小偃麥SN19和SN20，經(jīng)分子標(biāo)記檢測，SN19含有Sr26，SN20同時(shí)含有Sr25和Sr26。本研究利用不同小麥品種（系）分別與SN19、SN20進(jìn)行雜交、回交，并利用與Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)其后代進(jìn)行輔助選擇，定向培育攜帶Sr25、Sr26基因的小麥新種質(zhì)，為應(yīng)對(duì)Ug99入侵提供種質(zhì)儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究所用材料包括小麥品種濟(jì)麥22、泰農(nóng)18、山農(nóng)優(yōu)麥3號(hào)、煙農(nóng)15，本實(shí)驗(yàn)室選育的兩個(gè)八倍體小偃麥SN19、SN20和高代品系山農(nóng)126、山農(nóng)637。以上材料均由國家小麥改良中心泰安分中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種質(zhì)系的創(chuàng)制與選育 分別以八倍體小偃麥SN19、SN20為母本，以普通小麥品種（系）為父本進(jìn)行雜交、回交，在BC1F1世代利用分子標(biāo)記輔助選擇含有Sr25、Sr26的單株；以普通小麥為輪回親本與當(dāng)選單株再進(jìn)行回交、自交，利用分子標(biāo)記對(duì)每個(gè)世代進(jìn)行輔助選擇，結(jié)合溫室加代，以獲得含有Sr25、Sr26且性狀基本穩(wěn)定的種質(zhì)系。

1.2.2 性狀調(diào)查 參照李立會(huì)和李秀全[3]的方法。

1.2.3 DNA提取 采集新鮮小麥葉片，按CTAB法[4]提取DNA。

1.2.4 引物選擇 根據(jù)已發(fā)表的與抗稈銹病基因Sr25[11]、Sr26[10]緊密連鎖的分子標(biāo)記，由上海生工生物技術(shù)公司合成（表1）。

1.2.5 PCR反應(yīng)體系與程序 引物PSY-E1、Sr26#43+ BE518379的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序分別參照Zhang和Dubcovsky[11]、Liu等[10]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 攜帶Sr25種質(zhì)的選育

以普通小麥濟(jì)麥22、山農(nóng)優(yōu)麥3號(hào)、山農(nóng)637、山農(nóng)126為陰性對(duì)照，以八倍體小偃麥SN20為陽性對(duì)照，利用與Sr25緊密連鎖的標(biāo)記PSY-E1對(duì)各世代進(jìn)行選擇，不含Sr25的材料無擴(kuò)增產(chǎn)物，含有Sr25的材料在191 bp處擴(kuò)增出一條特異帶、如源于SN20/山農(nóng)637組合的單株204-1、204-3、204-5、204-7、205-1、205-3、205-4、205-5、206-1（圖1），源于SN20/濟(jì)麥22組合的單株180-1、180-2、180-3、180-4、180-10、181-1（圖2）均可擴(kuò)增出大小約191 bp的特異帶，說明這些單株含有Sr25，而其余單株則不含Sr25。

2.2 攜帶Sr26種質(zhì)的選育

分別以八倍體小偃麥SN19、SN20為陽性對(duì)照，以普通小麥親本為陰性對(duì)照，利用引物組合BE518379+Sr26#43對(duì)雜種后代進(jìn)行分子檢測。普通小麥只能在303 bp處由引物BE518379擴(kuò)增出一條源于小麥6A染色體的特異帶，陽性對(duì)照和含有Sr26基因的后代單株可以在207 bp處擴(kuò)增出一條由引物Sr26#43產(chǎn)生的Sr26特異帶。兩個(gè)標(biāo)記結(jié)合應(yīng)用，不但可以檢測Sr26基因的有無，還可以檢測普通小麥6A染色體是否發(fā)生變異。

由圖3、圖4可以看出，SN20與山農(nóng)優(yōu)麥3號(hào)雜交后代216-6、217-1、176-8、176-9、176-10單株，SN19與泰農(nóng)18雜交后代258-2、258-3、258-4、258-6、258-10、259-1、259-3、259-4、259-6、259-7、259-8單株可同時(shí)擴(kuò)增出207 bp和303 bp兩條特異帶，表明它們含有Sr26基因且6A染色體沒有發(fā)生變異；單株S258-7僅能擴(kuò)增出207 bp的特異帶，表明其含有Sr26基因，且6A染色體在引物BE518379位點(diǎn)處發(fā)生了變異；其余單株儀能擴(kuò)增出303 bp的特異帶，而沒有207 bp的特異帶，表明它們不含有Sr26，6A染色體也沒有發(fā)生變異。endprint

2.3 攜帶Sr25、Sr26種質(zhì)的性狀特點(diǎn)

對(duì)部分形態(tài)學(xué)基本穩(wěn)定的種質(zhì)進(jìn)行性狀調(diào)查，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，176-8、184-2、193-1、198-10四個(gè)種質(zhì)具有矮稈特點(diǎn)，株高介于64.8～69.2 cm之間；187-4、199-2、259-1、262-2株高中等；而186-2植株則較高，達(dá)111.5 cm。穗長方面，只有262-2為8.9 cm，其余皆超過9 cm，199-2和259-1則超過10 cm。就穗粒數(shù)而言，9個(gè)種質(zhì)結(jié)實(shí)性較好，其中184-2、259-1超過50粒。上述種質(zhì)不但含有Sr25和（或）Sr26基因，而且綜合農(nóng)藝性狀較好，可以作為親本在育種中加以利用。

3 討論與結(jié)論

強(qiáng)毒力小種Ug99及其變異菌株可以侵染全球約90%種植面積的小麥品種，因此引起了世界各國包括諾貝爾獎(jiǎng)獲得者布勞格博士的高度關(guān)注[8]。世界糧農(nóng)組織為此專門組織成立了“全球小麥銹病協(xié)作網(wǎng)”（The Global Rust Initiative），并提出了通過培育多抗性品種持久控制小麥稈銹病的策略[15]，而利用抗病基因創(chuàng)制抗病種質(zhì)是這一策略得以實(shí)施的基礎(chǔ)和前提。

Sr25源于長穗偃麥草，位于7E染色體長臂抗葉銹病基因Lr19末端，曾被轉(zhuǎn)移至小麥7D染色體上[16]，被CIMMYT廣泛應(yīng)用于小麥育種中[17]。該基因與高黃色素基因PSY-E1緊密連鎖，因此PSy-E1的特異引物可以作為特異標(biāo)記用于定向檢測Sr25。韓建東[18]、吳限鑫[19]等學(xué)者曾分別利用特異引物對(duì)我國150份小麥材料和云南省119份小麥品種（系）進(jìn)行檢測，均未檢測到Sr25，說明該基因在我國較為缺乏。本研究利用特異標(biāo)記PSY-E1，在八倍體小偃麥與濟(jì)麥22、山農(nóng)126、山農(nóng)637雜交后代中篩選出5個(gè)種質(zhì)，它們不但含有Sr25基因，而且綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，可以作為親本用于小麥育種，以改善我國缺乏Sr25基困的境況。

Sr26源于長穗偃麥草，位于6E染色體長臂，曾被轉(zhuǎn)移至小麥6AL上[16]。該基因可以抵抗Ug99及其變異菌株等許多優(yōu)勢小種[10]，自20世紀(jì)80年代廣泛應(yīng)用于澳大利亞小麥育種和生產(chǎn)以來，一直保持良好抗性，但在其他國家尚未得到應(yīng)用[8，9]。在我國，曾有多位學(xué)者通過基因推導(dǎo)分析法推測我國部分小麥品種可能含有Sr26[20～23]。2005年，Mago等開發(fā)了Sr26的STS顯性標(biāo)記Sr26#43，并用于分子標(biāo)記輔助選擇[12]。之后，經(jīng)Liu等[10]驗(yàn)證，將小麥6A染色體特異標(biāo)記BE518379與Sr26#43相結(jié)合，可以作為共顯性標(biāo)記用于Sr26的分子診斷，李偉華[24]利用Sr26#43對(duì)我國北方448個(gè)小麥品種進(jìn)行檢測，結(jié)果只有墾九10號(hào)和保豐104兩個(gè)品種含有Sr26本研究結(jié)合應(yīng)用Sr26#43和BE518379兩個(gè)標(biāo)記，在八倍體小偃麥與普通小麥品種（系）雜交后代中，選育出5個(gè)含有Sr26基因的種質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)其6A染色體均沒有發(fā)生變異，推測其中的Sr26基因可能轉(zhuǎn)移到了小麥的其它染色體上。

本研究選用農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥品種（系）與八倍體小偃麥雜交、回交，在分離后代中利用與抗稈銹病基因Sr25、Sr26緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，定向培育了4個(gè)含有Sr25、4個(gè)含有Sr26、1個(gè)同時(shí)含有Sr25和Sr26的小麥新種質(zhì)這些新種質(zhì)結(jié)實(shí)性好，綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良，可以作為育種親本用于小麥抗稈銹病育種，以應(yīng)對(duì)Ug99威脅。endprint