劉勝男+張華+柳絮+李廣賢+楊永義+姚方印

摘要：本試驗以帶有華粳秈74遺傳背景的單片段代換系與華粳秈74雜交得到的F2代次級分離群體為試驗材料，利用與華粳秈74農(nóng)藝性狀差異極顯著的單株進(jìn)行重疊群作圖分析，在W06-40-48-06-2-l代換片段上鑒定出了一個株高QTL、一個粒長寬比QTL和一個千粒重QTL。

關(guān)鍵詞：水稻；單片段代換系；農(nóng)藝性狀；重疊群作圖；QTL

中圖分類號：S511.032 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2015）04-0008-05

水稻是我國最重要的糧食作物之一，種植面積約占糧食作物總而積的百分之三十，產(chǎn)量近糧食總產(chǎn)量的一半[2]。水稻的許多性狀如抽穗期、株高、千粒重、粒長粒寬及其長寬比等都是數(shù)量性狀，這些數(shù)量性狀有較為復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)。對控制這些性狀的基因進(jìn)行定位并研究其遺傳效應(yīng)具有重要的理論和現(xiàn)實意義。目前有關(guān)水稻數(shù)量性狀的QTL定位有很多報道，但已克隆的基因相對較少，多數(shù)QTL不能深入研究。應(yīng)用初級定位群體（F2、DH和RIL等）對QTL進(jìn)行檢測相對比較容易，但由于材料的遺傳背景和群體大小的限制，定位得到的QTL置信區(qū)間往往很大，一般為10～30 cM，因此不能確定是單基因還是多基因的效應(yīng)。而且，由于遺傳背景分離比較復(fù)雜，微效QTL表達(dá)效應(yīng)容易受主效QTL表達(dá)的干擾，不能得到穩(wěn)定檢測。因此，利用初級群體為材料定位水稻數(shù)量性狀QTL精度較低，其結(jié)果可能與實際偏差較大[2]。為了消除QTL定位時遺傳背景產(chǎn)生的不利影響，提高檢測的靈敏度和定位的精確度，Tuinstra等[3]提出了一種思路和方法，利用相似遺傳背景下的次級群體進(jìn)行QTL作圖。次級群體主要包括近等基因系（near-isogenic line，NIL）、染色體片段代換系（chromosome segment substitution line.CSSL）和導(dǎo)入系（introgression line，IL）等，這些次級群體的共同特點是遺傳背景相似，僅帶有的供體代換片段不同，應(yīng)用這些次級群體對QTL進(jìn)行鑒定和定位時，能提高定位與鑒定的精確度[4]。目前，已利用多個次級群體對水稻QTL進(jìn)行精細(xì)定位與鑒定，例如，Yamamoto等[5]利用水稻單片段代換系精細(xì)定位了抽穗期基因Hd1、Hd2和Hd3；Takahashi等[6]定位了水稻抽穗期基因Hd6。由此可見，次級群體在作物QTL定位與檢測中有較高應(yīng)用價值。

收稿日期：2014-12-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31171529）；山東省農(nóng)業(yè)生物資源創(chuàng)新利用課題；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點項目（2014CXZ10-2）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（水稻）項目

千粒重（1 000-grain weight，KGW）是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項指標(biāo)，是檢驗種子質(zhì)量和作物考種的內(nèi)容，也是田間預(yù)測產(chǎn)量的重要依據(jù)。對控制千粒重QTL的定位有利于從分子水平上探討其生理機(jī)理和遺傳機(jī)制，達(dá)到對產(chǎn)量和品質(zhì)的合理調(diào)控[7]。株高與水稻的抗倒伏性顯著相關(guān)，因此株高對產(chǎn)量有重要的作用。20世紀(jì)60年代初，在世界范圍內(nèi)掀起了一場綠色革命，倡導(dǎo)水稻矮稈化，大大提高了水稻產(chǎn)量，從而解決了多個發(fā)展中國家糧食自給問題。到目前為止，有很多定化水稻株高QTL的研究，水稻12條染色體上都分布著株高QTL。有研究者[8]采用Windows QTL Cartographer 2.5進(jìn)行株高、千粒重的QTL分析，這兩個農(nóng)藝性狀在抽穗期基因RFT1-Hd3a所處區(qū)間和Hd1所處區(qū)間均有顯著作用，并且兩個性狀在Hd1所處區(qū)間的作用均強(qiáng)于RFT1-Hd3a所處區(qū)間。粒長、粒寬及其長寬比是研究籽粒性狀的土要指標(biāo)，其中粒長最能反映籽粒性狀。目前有很多關(guān)于水稻粒長、粒寬QTL定位的研究，其中有119個粒長相關(guān)QTL被定位，分布在水稻12條染色體上。很多研究結(jié)果顯示，一般在一個群體中能檢測到3～8個控制粒長的QTL，分布于2～5條不同的染色體上，隨著研究的不同，單個QTL的貢獻(xiàn)率差異也較大。有研究者[9]利用水稻JF171/Samba群體和JF222/JF178群體構(gòu)建了兩個連鎖群，兩群體均在2號染色體上檢測到控制谷粒粒型和千粒重的主效QTL，位于2號染色體長臂中下部一個相對較小的區(qū)間RM263-RM318內(nèi)，這些主效QTL以加性效應(yīng)為主，圖譜距離約為18 cM、黃成[10]利用兩個粳稻品種沈農(nóng)265和麗江新團(tuán)黑谷進(jìn)行雜交，構(gòu)建了176株F2代次級分離群體，定位到5個控制粒長的QTL、4個控制粒寬的QTL、4個控制千粒重的QTL。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗單片段代換系W06-40-48-06-2-1和受體親本華粳秈74均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)張桂權(quán)教授惠贈，單片段代換系W06-40-48-06-2-1的代換片段米源于供體Katy，位于第8染色體上，其余遺傳背景與華粳秈74相同。本試驗選用代換系W06-40-48-06-2-1與華粳秈74雜交得到的F2代次級分離群體作為試驗材料進(jìn)行第8染色體上有關(guān)水稻株高、千粒重、谷粒粒型的QTL定位

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 試驗在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心飲馬泉實驗場進(jìn)行。分別在2013年4月20日播種、6月2日插秧和2014年4月28日播種、6月1日插秧，以株距15 cm、行距25 cm插秧種植，正常田間管理。

1.2.2 指標(biāo)測量 株高：株高是水稻成熟期之后從莖基部至穗頂部的高度，每株測量兩次，取平均值作為株高。千粒重：水稻成熟后于室內(nèi)選擇100粒已烘干飽滿的種子，用天平稱重，并折算成千粒重。粒長：每個樣品隨機(jī)挑選出10粒成熟飽滿的種子，首尾相連，不重疊放在坐標(biāo)紙上排成行，測量其長度，重復(fù)兩次，求平均值即為粒長粒寬：每個樣品隨機(jī)挑選出10粒成熟飽滿的種子，并排放在坐標(biāo)紙上排成一行，測量其寬度，重復(fù)兩次，求平均值即為粒寬。谷粒的長度比即為谷粒粒型。endprint

1.2.3 QTL鑒定 通過t測驗比較單片段代換系W06-40-48-06-2-1與受體親本華粳燦74之間的差異顯著性，以華粳秈74多個小區(qū)的觀察值合并為一個群體作對照。進(jìn)行QTL鑒定時，當(dāng)單片段代換系的某個性狀與對照同一性狀之間t測驗的概率值P≤0.0001時，則認(rèn)定該單片段代換系內(nèi)的代換片段上存在一個該性狀的QTL。

1.2.4 QTL加性效應(yīng)值的估算方法 本試驗參照Eshed & Zamir（1995）的方法估算各個QTL的加性效應(yīng)值及加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率。所用公式為：

加性效應(yīng)值=（純合SSSL的表型值-對照的表型值）/2；

加性效應(yīng)貢獻(xiàn)率（%）=（加性效應(yīng)值/對照的表型值）×100。

1.2.5 微衛(wèi)星標(biāo)記分析 根據(jù)本實驗室構(gòu)建的微衛(wèi)星標(biāo)記圖譜，選擇代換片段上的35對微衛(wèi)星標(biāo)記對代換系和華粳秈74進(jìn)行多態(tài)性檢測。篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物，利用多態(tài)性引物對單株進(jìn)行擴(kuò)增，帶型結(jié)果以數(shù)字表示：“1”表示基因型與華粳秈74親本相同，“3”表示與單片段代換系親本相同，“2”為雜合帶型。所有引物郁是由上海生工合成。

1.2.6 重疊群作圖 重疊群作圖法是利用有重疊區(qū)域的代換片段進(jìn)行QTL定位的方法。其原理如圖1，sssL1和SSSL2在M2M3區(qū)段相互重疊，在進(jìn)行QTL鑒定時如果在SSSL1上檢出某個性狀的QTL而在SSSL2上未檢出，則認(rèn)為這個QTL在M1M2區(qū)段上（Q1）；如果在SSSL1和SSSL2上同時檢出某個性狀的QTL，則認(rèn)為這個QTL在M2M3區(qū)段上（Q2）；如果在SSSL2上檢出某個性狀的QTL而在SSSL1上未檢出，則認(rèn)為這個QTL在M3M4區(qū)段上（Q3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 QTL鑒定

對10株代換系W06-40-48-06-2-1和10株華粳秈74株高、千粒重、粒長寬比進(jìn)行測量，P值分別為1.92×10-5、1.37×10-6、1.41×10-5，均小于0.0001，說明代換系的代換片段上存在一個株高QTL，命名為qPH8；一個千粒重QTL，命名為qKGW8；一個粒長粒寬QTL，命名為qGS8。

選取F2代次級分離群體中極端株高13株（1～13），對株高QTL進(jìn)行加性效應(yīng)分析（表1）。從F2代次級分離群體中隨意挑選10株，測量千粒重、粒長粒寬，選擇與華粳秈74有顯著差異的單株（千粒重和粒型單株各4株），并對其進(jìn)行千粒重和粒型QTL的加性效應(yīng)分析（表2、3）。

2.2 用于重疊群作圖的F2代單株代換片段的確定

根據(jù)本實驗室構(gòu)建的微衛(wèi)星標(biāo)記圖譜，選擇親本代換片段上的35對微衛(wèi)星標(biāo)記對代換系和華粳秈74進(jìn)行多態(tài)性檢測，篩選出在兩親本間具有多態(tài)性的引物RM152、PSM151、PSM155、RM25、RM547、RM72、RM404。利用7對多態(tài)性引物對21個F2代單株（同表1、2、3）進(jìn)行擴(kuò)增，基因型檢測結(jié)果如表4，單株的代換片段如表5。每一單株都含有一條代換片段。

2.3 重疊群作圖

利用編號為1～13的F2單株進(jìn)行重疊群作圖，qPH8被界定在笫8染色體PSM155和RM547兩標(biāo)記之間，估計長度約7.7 cM（圖2）。攜帶qPH8等位基因的單株在其他條件相同的情況下株高高于受體華粳秈74，說明等位基因qPH8具有促進(jìn)受體親本華粳秈74長高的效應(yīng)，其加性效應(yīng)值介于9.0～13.0 cm之間（表1）。

利用編號為F2027和F2051的4個F2單株進(jìn)行重疊群分析，qKGW8介于笫8染色體分子標(biāo)記PSM151和RM547之間，兩標(biāo)記之間的估計長度為20.2 cM（圖2）。攜帶qKGW8等位基因的4個單株平均粒重都重于受體華粳秈74，說明等位基因qKGW8能夠促使華粳秈74千粒重效應(yīng)值增加，其加性效應(yīng)為1.04～1.57 g（表2）。

利用編號為F2023的4個F2單株形成重疊群，qGS8介于第8染色體分子標(biāo)記PSM155和RM25之間，兩標(biāo)記之間的估計長度為3.0 cM（圖2）。攜帶qGS8等位基因的4個單株粒長寬比都大于受體華粳秈74，說明等位基因qGS8能夠促使華粳秈74粒長寬比效應(yīng)值增加，其加性效應(yīng)為0.095～0.205（表3）。

3 討論

利用單片段代換系進(jìn)行QTL定位與傳統(tǒng)的定位方法相比具有很大的優(yōu)勢，單片段代換系只帶有一個供體片段，其它組成與受體基因組完全相同，這一特點消除了遺傳背景及QTL之間的相互干擾，使QTL的定位更精確。在單片段代換系構(gòu)建過程中，復(fù)雜性狀的QTL被分解為多個單一的Mendel因子，利用重疊群定位可以把QTL定位在較小的區(qū)域內(nèi)。此外，單片段代換系在遺傳上更穩(wěn)定，可以多地點、多季節(jié)、多年用于QTL分析。

本試驗利用重疊群作圖在代換片段上找到一個株高QTL（qPH8）、一個千粒重QTL（qKGW8）和一個粒型QTL（qGS8），為其精細(xì)定位及基因克隆奠定基礎(chǔ)。qGS8、qPH8和qKGW8在第8染色體上的位置與功能均和已克隆的抽穗期基因Ghd8相似，Ghd8對水稻抽穗期和產(chǎn)量性狀兼具主效作用，其遲熟等位基因提高株高、每穗實粒數(shù)、每穗總粒數(shù)和產(chǎn)量[3]。endprint