顧天天 朱鵬飛 王春園 王夢(mèng)芝 張艷云

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

益生菌制劑作為一種高效、安全的飼料添加劑，能明顯提高畜禽腸道乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益微生物的數(shù)量，使大腸桿菌和沙門氏菌的數(shù)量顯著減少。益生菌制劑的作用在家禽生產(chǎn)中尤為顯著，主要表現(xiàn)為調(diào)節(jié)腸道菌群［1］；減少腸道有害菌群的感染［2］；提高蛋品質(zhì)，改善生產(chǎn)性能［3－4］；此外，部分研究還表明，有些益生菌如巨大芽孢桿菌1259（Bacillus magaterium1259，BM1259）的添加還能減少蛋雞排泄物中硫化物、氨態(tài)氮的濃度，提高氮的利用率從而減少雞舍內(nèi)氨氣及硫化氫的排放，有效改善雞舍內(nèi)的氣體環(huán)境［5］，而對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的改善和環(huán)境的保護(hù)有著重要的意義。芽孢桿菌作為目前研究應(yīng)用較多的新型益生菌，是一種屬于革蘭氏陽(yáng)性菌的好氧菌，易產(chǎn)生具有特殊結(jié)構(gòu)的芽孢，使其在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及高溫（100℃）條件下能夠生存，同時(shí)耐擠壓，有利于飼料的加工，在酸性條件下具有較高的穩(wěn)定性并能分泌活性較強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和多種氨基酸［6］。其中枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及東洋芽孢桿菌等被廣泛使用［7］。李俊波等［8］報(bào)道在蛋雞飼糧中添加枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌可提高蛋雞的生產(chǎn)性能并提高健康狀況。BM1259是正在研究開發(fā)的微生物制劑，其一般功效與其他芽孢桿菌相似［9］。本課題組前期的研究已經(jīng)表明，蛋雞飼糧添加BM1259的2組產(chǎn)蛋率分別為73.31%、73.61%，均顯著高于對(duì)照組，且試驗(yàn)組間均無顯著差異，添加BM1259有效提高了蛋雞產(chǎn)蛋率，降低料蛋比，提高蛋白質(zhì)和能量的消化率［10］，降低氮和硫的排泄［5］。但蛋雞飼糧中添加BM1259后，其在消化道中對(duì)微生物菌群的影響尚不得而知。本試驗(yàn)即以新?lián)P州蛋雞為研究對(duì)象，研究BM1259對(duì)產(chǎn)蛋期蛋雞不同腸段微生物群體的影響，以求初步闡明益生菌BM1259在蛋雞消化道對(duì)微生物群體作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的BM1259制劑由“新型生物飼料添加劑——BM1259的研制”課題組提供。試用產(chǎn)品批號(hào)20100318，含活孢子數(shù)1×1011個(gè)／g；Quant SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa；PCR儀為美國(guó)ABI公司的7500；三羥甲基氨基甲烷鹽酸（Tris－Cl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、苯酚／氯仿／異戊醇（V／V／V＝25／24／1）、氯仿／異戊醇（V／V＝24／1）、異丙醇和乙醇為國(guó)產(chǎn)試劑，蛋白酶K購(gòu)于上海生工生物股份有限公司，引物由上海生工生物股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2013年11月至12月在揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)選用健康、生長(zhǎng)狀況相近的45周齡，產(chǎn)蛋率90%的新?lián)P州蛋雞128只，隨機(jī)將其分為2個(gè)組，每組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8只蛋雞，預(yù)試期1周，正試期3周。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧；試驗(yàn)組飼糧在基礎(chǔ)飼糧中添加2×106CFU／g BM1259制劑?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet（air－dry basis） %

1.3 飼養(yǎng)管理

揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場(chǎng)雞舍為半開放式雞舍，階梯式3層籠養(yǎng)，單籠飼養(yǎng)。采用自動(dòng)飲水器和食槽飼喂，自然光照。試驗(yàn)期間07：00、16：00各喂料1次，自由采食、飲水，保持雞舍干凈衛(wèi)生，定期觀察雞群的活動(dòng)狀況，保證雞群健康。

1.4 樣品采集

分別于正試期的第1、2、3周末晨飼前隨機(jī)從各組抽取8只試驗(yàn)雞，在宰殺前30min將消毒處理的糞盤放置于各層雞籠下方用于采集雞糞樣品；而后即可進(jìn)行宰殺，并迅速在冰盤上無菌分離小腸和盲腸，從各部位擠出內(nèi)容物采集樣品。將樣品分別裝入離心管并置于－20℃冰箱冷凍保存，用于進(jìn)行DNA提取。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 細(xì)菌 DNA的提取

將收集的樣品依照奧斯伯［11］的方法提取DNA。

1.5.2 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）法檢測(cè)

從基因庫(kù)（GenBank）上獲取不同菌株序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件分析設(shè)計(jì)特異性PCR引物（表2）。PT－PCR反應(yīng)條件為：1）95℃預(yù)變性30s；2）95℃變性5s，60℃退火和延伸34s并采集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)；3）熔解曲線分析，以0.1℃／s的速度從60℃升至95℃，60和95℃各保溫15s，每升0.1℃采集1次熒光。以細(xì)菌U（Bacterial－U）為內(nèi)參，計(jì)算各部位微生物的相對(duì)含量。

表2 RT－PCR檢測(cè)細(xì)菌引物列表Table 2 The primers list of detected bacteria in RT－PCR

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示，試驗(yàn)采用Excel 2003建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用SPSS 17.0軟件中的one－way ANOVA的Duncan氏法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

由圖1、圖2可知，本試驗(yàn)中RT－PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2在0.99以上；溶解曲線峰單一，可用于所研究微生物的相對(duì)定量。

圖1 RT－PCR試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 The standard curve of RT－PCR experiment

圖2 RT－PCR試驗(yàn)的溶解曲線圖Fig.2 The melt curve of RT－PCR experiment

2.1 巨大芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋雞小腸內(nèi)容物中微生物群體的影響

由表3可知，在正試期第1周，與對(duì)照組相比，雖然大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌在小腸內(nèi)的含量降低，但差異不顯著（P＞0.05）；雙歧桿菌、擬桿菌在小腸中的含量顯著提高（P＜0.05）；巨大芽孢桿菌含量也有提升，但差異不顯著（P＞0.05）。在正試期的第2周，與對(duì)照組相比，大腸桿菌含量降低，但差異不顯著（P＞0.05）；沙門氏菌、腸球菌含量顯著降低（P＜0.05）；乳酸菌含量有所提高，但差異不顯著（P＞0.05）；雙歧桿菌、擬桿菌、巨大芽孢桿菌含量顯著升高（P＜0.05）。在正試期的第3周，與對(duì)照組相比，大腸桿菌、腸球菌含量降低不顯著（P＞0.05）；沙門氏菌含量降低顯著（P＜0.05）；乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌含量提高不顯著（P＞0.05）；而巨大芽孢桿菌含量則顯著升高（P＜0.05）。

由圖3可知，在正試期期間，試驗(yàn)組有害菌數(shù)量均少于對(duì)照組，有益菌數(shù)量均多于對(duì)照組。

從總體上說，在整個(gè)試驗(yàn)期，無論試驗(yàn)組還是對(duì)照組，沙門氏菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌在小腸內(nèi)容物中的含量都表現(xiàn)為降低趨勢(shì)；大腸桿菌、巨大芽孢桿菌含量則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；腸球菌含量基本保持不變。

表3 巨大芽孢桿菌1259對(duì)產(chǎn)蛋雞小腸內(nèi)容物中微生物群體的影響Table 3 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in small intestine contents of laying hens

圖3 巨大芽孢桿菌1259對(duì)產(chǎn)蛋雞小腸內(nèi)容物中微生物群體的變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups in small intestine contents

2.2 巨大芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸內(nèi)容物中微生物群體的影響

由表4可知，在正試期第1周，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組盲腸內(nèi)沙門氏菌、雙歧桿菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；大腸桿菌含量略低于對(duì)照組，差異不顯著（P＞0.05）；巨大芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；乳酸桿菌、腸球菌、擬桿菌含量高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。在正試期第2周，試驗(yàn)組大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；沙門氏菌含量低于對(duì)照組，差異不顯著（P＞0.05）；擬桿菌含量高于對(duì)照組且差異不顯著（P＞0.05）；巨大芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在正試期的第3周，大腸桿菌、擬桿菌含量高于對(duì)照組且差異不顯著（P＞0.05）；沙門氏菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌含量低于對(duì)照組，差異不顯著（P＞0.05）；巨大芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

由圖4可知，在正試期期間，試驗(yàn)組有害菌數(shù)量均少于對(duì)照組，有益菌數(shù)量均多于對(duì)照組，且有益菌占主要比例。

在整個(gè)試驗(yàn)期，無論試驗(yàn)組還是對(duì)照組，大腸桿菌在小腸內(nèi)容物中的含量都表現(xiàn)為降低趨勢(shì)；乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、巨大芽孢桿菌含量則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；沙門氏菌、擬桿菌含量基本保持不變。

表4 巨大芽孢桿菌1259對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸內(nèi)容物中微生物群體的影響Table 4 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in cecum contents of laying hens

圖4 巨大芽孢桿菌1259對(duì)產(chǎn)蛋雞盲腸內(nèi)容物中微生物群體的變化趨勢(shì)Fig.4 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups of cecum

2.3 巨大芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋雞糞便微生物群體的影響

由表5可知，在正試期第1周，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組糞便中大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌、巨大芽孢桿菌含量高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。在正試期第2周，試驗(yàn)組糞便中大腸桿菌、沙門氏菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；乳酸桿菌、腸球菌含量低于試驗(yàn)組且差異不顯著（P＞0.05）；雙歧桿菌、擬桿菌、巨大芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。在正試期第3周，試驗(yàn)組糞便中大腸桿菌、沙門氏菌含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；腸球菌含量低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；乳酸桿菌、巨大芽孢桿菌含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；雙歧桿菌、擬桿菌含量高于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）。

由圖5可知，在正試期期間，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組有害菌數(shù)量呈減少趨勢(shì)，有益菌數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，且有益菌占主導(dǎo)地位。

在整個(gè)試驗(yàn)期間，對(duì)照組和試驗(yàn)組中，大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌含量呈下降趨勢(shì)；而雙歧桿菌、擬桿菌、巨大芽孢桿菌含量呈上升趨勢(shì)。

表5 巨大芽孢桿菌1259對(duì)產(chǎn)蛋雞糞便微生物群體的影響Table 5 Effects of Bacillus magaterium1259on microbial groups in faeces of laying hens

圖5 巨大芽孢桿菌1259對(duì)對(duì)照組產(chǎn)蛋雞糞便微生物群體的變化趨勢(shì)Fig.5 The change trend of Bacillus magaterium1259on microbial groups of faeces

3 討 論

大腸桿菌、沙門氏菌、腸球菌為蛋雞腸道中的有害菌；而乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌和巨大芽孢桿菌等則是有益菌。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中蛋雞消化道內(nèi)容物和糞便的大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌數(shù)量減少，雙歧桿菌、巨大芽孢桿菌等有益菌數(shù)量增加，與景翠等［12］在蛋雞飼糧中添加地衣芽孢桿菌的試驗(yàn)結(jié)果相似。景翠等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加地衣芽孢桿菌能減少大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量相似。同時(shí)本試驗(yàn)結(jié)果中腸道各個(gè)部位大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌群數(shù)量都有所下降，乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益菌群數(shù)量有所提高，以盲腸內(nèi)容物和糞便中最為明顯，這與陳國(guó)營(yíng)等［13］試驗(yàn)證明添加枯草芽孢桿菌能提高盲腸、直腸內(nèi)容物及糞便乳酸桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量相似。這可能是由于巨大芽孢桿菌進(jìn)入畜禽動(dòng)物腸道后與需氧菌形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，奪取氧氣，造成低氧環(huán)境，抑制了有害菌群的生長(zhǎng)，同時(shí)改善了腸道中的厭氧環(huán)境，為乳酸桿菌等有益菌創(chuàng)造了增殖的條件，有利于有益菌的生長(zhǎng)，保持腸道微生物系統(tǒng)的平衡［14－15］。由于乳酸桿菌、雙歧桿菌、擬桿菌在動(dòng)物腸道內(nèi)能產(chǎn)生有機(jī)酸（如乙酸、丙酸、乳酸、脂肪酸等），使動(dòng)物腸道保持酸性的條件，而大腸桿菌等有害菌群適宜在中性偏堿的環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，因此酸性的腸道環(huán)境抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的生長(zhǎng)，促進(jìn)乳酸桿菌等有益菌群的繁殖［14－16］。此外，丁軻等［17］報(bào)道，乳酸桿菌可通過產(chǎn)生酸性物質(zhì)、抗菌成分以及各種酶等代謝產(chǎn)物抑制有害菌的活性，從而減少有害菌的數(shù)量。同時(shí)芽孢桿菌使黏附在腸黏膜上皮細(xì)胞上的雙歧桿菌、擬桿菌等競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原微生物，同大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌爭(zhēng)奪有限的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位點(diǎn)，從而阻礙大腸桿菌與其相應(yīng)受體結(jié)合，繼而抑制有害菌群定植，阻礙有害菌的生長(zhǎng)繁殖，從而限制有害菌群的生長(zhǎng)，提高有益菌群的繁殖［18］。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，飼糧加入BM1259后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，試驗(yàn)組有害菌數(shù)量明顯降低，有益菌數(shù)量逐漸增加。這與周小輝等［19］報(bào)道動(dòng)物飼喂芽孢桿菌后能顯著降低腸道大腸桿菌的數(shù)量，使有益菌數(shù)量增加而致使有害菌數(shù)量減少，從而增加排泄物中的有益菌數(shù)量一致。同樣，蠟樣芽孢桿菌SA38在體外對(duì)雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、大腸桿菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌對(duì)雞白痢沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌有明顯的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌也有一定的抑制作用［20］。全艷玲［21］用體外試驗(yàn)也證實(shí)，地衣芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌有抑制作用，對(duì)雙歧桿菌、乳酸桿菌有共生而無拮抗作用。以上抑菌作用可能是由于芽孢桿菌在代謝過程中產(chǎn)生一些抗生物質(zhì)（分子質(zhì)量約1 400u的多肽物質(zhì)），主要包括伊短菌素（堿性多肽物質(zhì)，能抑制DNA合成）、桿菌肽（環(huán)多肽，能抑制細(xì)胞壁合成）和短桿菌素－多黏菌素－短桿菌酪肽類的線多肽抗生素（能改變細(xì)胞膜的構(gòu)造和功能），這3種抗生物質(zhì)可有效抑制有害菌在腸道的生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌的繁殖［22］。此外還可能是由于芽孢桿菌在厭氧條件下通過糖酵解作用產(chǎn)生一系列有機(jī)酸，如揮發(fā)性脂肪酸，這些物質(zhì)可以降低雞腸道內(nèi)的pH，有效抑制有害菌的生長(zhǎng)，為乳酸菌等耐酸性細(xì)菌創(chuàng)造生長(zhǎng)的條件所致［23］。

巨大芽孢桿菌的添加除通過維持消化道菌群的平衡、改善消化道酸性環(huán)境從而利于機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［23］，提高蛋雞的生產(chǎn)性能外；還可以通過降低氮、硫的排泄，緩解養(yǎng)殖環(huán)境的污染狀況。李曉剛等［5］前期的試驗(yàn)結(jié)果表明，基礎(chǔ)飼糧中添加巨大芽孢桿菌后，排泄物中氨態(tài)氮及可溶性硫化物的產(chǎn)生量明顯減少。這可能是由于大腸桿菌代謝產(chǎn)生氨氣［24］，沙門氏菌代謝產(chǎn)生氨和硫化氫［25］，而在飼用巨大芽孢桿菌后大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量顯著減少，從而降低了氨態(tài)氮及可溶性硫化物的釋放速度；研究同時(shí)還表明，巨大芽孢桿菌還降低了腸道中脲酶、尿酸酶的活性，從而減緩尿酸和尿素的分解，減少硫化氫（H2S）的排出量［8］，而具有緩解排泄物污染的效應(yīng)。此外，氨、胺和H2S等物質(zhì)對(duì)腸道黏膜細(xì)胞有毒害作用，巨大芽孢桿菌的添加緩解這些物質(zhì)的釋放，也對(duì)腸黏膜有一定的保護(hù)作用而提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

4 結(jié) 論

本研究的結(jié)果顯示，產(chǎn)蛋期蛋雞飼糧添加BM1259可減少腸道大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌的數(shù)量，提高乳酸桿菌、擬桿菌等有益菌的數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群，有效抑制病原微生物的生長(zhǎng)，減少有害菌的感染，從而改善家禽的生產(chǎn)性能，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)。

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