王銀龍 單鐵英 潘秀蘭河北工程大學附屬醫(yī)院 邯鄲 056002

成肌細胞治療DMD模型-mdx鼠體內骨骼肌細胞dystrophin/utrophin蛋白的表達

王銀龍 單鐵英 潘秀蘭
河北工程大學附屬醫(yī)院 邯鄲 056002

目的 研究成肌細胞移植入放療的mdx鼠后dystrophin/utrophin的表達變化。方法 培養(yǎng)大鼠L6骨骼肌成肌細胞株（L6SkM），進行肌內注射于Duchenne型模型鼠-mdx鼠。移植后1個月、2個月、3個月分別取實驗鼠的四肢骨骼肌，運用免疫熒光法、Western blot檢測dystrophin及utrophin的表達情況。另分別取5只正常C57BL/6鼠和mdx鼠作陽性和陰性對照。結果 成肌細胞移植后1、2和3個月后mdx鼠的dystrophin表達隨移植時間延長增多，而utrophin的表達隨移植時間延長下降。結論 成肌細胞移植后dystrophin表達對utrophin有一定的抑制作用，兩者存在互補關系。

成肌細胞；mdx鼠；細胞移植；抗肌萎縮蛋白；utrophin

成肌細胞移植（myoblast transfer thearpy，MTT）是用外源性正常的成肌細胞注射到宿主的肌細胞中，使之互相接觸，按肌纖維細胞正常發(fā)育的成熟程序而相互融合成異核、多核的肌纖維細胞，從而誘導形成新的、健康的dystrophin陽性的肌纖維。Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥是一種X-性連鎖隱性遺傳病，在男性活嬰中的發(fā)病率為1/3 500，居神經遺傳病之首［1］，一般3～5歲起病，常于20～30歲死于呼吸和（或）循環(huán)衰竭。病因主要由于X染色體短臂2區(qū)1帶（Xp21）基因突變導致細胞膜骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白（dystrophin）缺乏所致，病程進展快，預后差，目前臨床尚無有效治療方法［2］。

組織發(fā)生學表明，成肌細胞是骨骼肌前體細胞，來源于中胚層干細胞，隨著胚胎的發(fā)育，成肌細胞分裂、融合到肌管而形成多核的骨骼肌纖維細胞［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，DMD模型mdx鼠由于抗肌萎縮蛋白的同源蛋白utrophin表達上調，可部分補償抗肌萎縮蛋白功能使其肌肉萎縮的癥狀較輕［5］，干細胞移植后證實來自供體的干細胞可在受體mdx鼠體內表達抗肌萎縮蛋白，但移植后utrophin表達情況較少見報道。本研究將L6骨骼肌成肌細胞（L6SKM）移植入放療的mdx鼠檢測dystrophin及utrophin的表達變化，以評價干細胞移植的治療效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 大鼠L6骨骼肌成肌細胞株（L6SkM）（上海中華細胞庫）；PBS和DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）。山羊正常封閉血清、兔正常封閉血清（福州邁新生物技術開發(fā)公司）；兔抗dystrophin多克隆抗體及兔抗utrophin多克隆抗體（Santa-Cruz公司）；山羊抗兔IgG二抗（Santa-Cruz公司）。

1.2 實驗動物及分組 受體鼠為齡鼠8～10周mdx鼠10只，購于美國Jackson實驗室，體質量16～20g，雌雄不限，平均分為5組，設為未移植組和L6SKM細胞移植1、2和3個月組，另取5只正常C57BL/6鼠作陽性和陰性對照

1.3 L6SkM的培養(yǎng) 復蘇的L6SkM接種在75cm2培養(yǎng)瓶，加DMEM培養(yǎng)基（含10％新生牛血清，青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL）置5％CO2、飽和濕度、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每24h換液，為保持其理想未分化狀態(tài)，當細胞達到60％～70％匯合時，即進行傳代。取3～5代生長狀態(tài)良好的細胞用于以下實驗。

1.4 成肌細胞的肌內注射 mdx鼠和C57BL/6鼠，于注射前1周輕微擠壓雙下肢肌肉，注射前1d，用環(huán)孢素A 50 mg·kg-1·d-1皮下注射抗排斥反應，直至實驗取材。注射前用戊巴比妥30mg/kg腹腔內注射輕度麻醉動物，剪開下肢皮膚，用30號微量注射針（直徑30μm）沿45°斜角，相隔約1 mm，3個點將成肌細胞注射于脛骨前肌和腓腸肌。每只鼠的對側下肢用DMEM培養(yǎng)基注射做對照。mdx鼠分成2組（1個月、2個月齡鼠各6只），成肌細胞注射劑量為50×104μL；C57BL/6鼠分2組（鼠齡分組與mdx鼠相同），成肌細胞注射劑量同mdx鼠。C57BL/6鼠于細胞移植后1～10d取骨骼肌觀測注射細胞分布情況，mdx鼠于移植后2周～3個月取肌內組織檢測各項指標。

1.5 冰凍切片制備及免疫熒光檢測dystrophin及utrophin的表達 冰凍切片制備：取各組新鮮鼠的腓腸肌標本放于液氮預冷的異戊烷中速凍3～5s，然后放入-25℃恒冷切片機中行橫斷面冰凍切片，-70℃保存。

免疫熒光檢測：空氣風干15min，PBS水化5min共3次，3％H2O2封閉10min，即用型山羊血清封閉30min，1：200抗dystrophin和utrophin抗體4℃孵育過夜，1∶200山羊抗兔FITC-IgG孵育1h，碘化匹啶（propidine iodide，PI）反染。運用激光共聚焦顯微鏡照像，并用全自動圖像分析系統(tǒng)（Alpha，美國）進行圖像分析，得出抗肌萎縮蛋白陽性纖維數(shù)。

1.6 Western blotting 檢測dystrophin及utrophin的表達取C57BL/6鼠、對照組mdx鼠及移植后各個時間點mdx鼠腓腸肌，組織裂解液裂解組織提取蛋白，變性后調整蛋白濃度20μg/μL，上樣10μL進行4％～7％梯度SDS-PAGE凝膠電泳，500mA恒流轉膜12～15h至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉1h；抗兔多克隆dystrophin抗體或抗山羊多克隆utrophin抗體（均以1∶600稀釋）室溫孵育1h，HRP標記的羊抗兔IgG或兔抗羊IgG（均為1∶1 000稀釋）室溫孵育1 h，化學發(fā)光劑顯色。另外制備12％分離膠做GAPDH的Western blot作為內參對照，均以預染Marker作為分子量對照。結果用紫外線透射凝膠圖像掃描儀進行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 14.0軟件進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光法檢測L6SKM細胞移植后mdx鼠dystrophin的表達變化 抗肌萎縮蛋白抗體染色顯示，對照C57BL/6鼠肌膜呈明顯完整的網狀綠色熒光，PI反染示細胞核居邊；mdx鼠肌膜未見綠色熒光，大部分細胞核中移，部分居邊。經成肌細胞L6SkM移植后2周的mdx鼠骨骼肌細胞膜無熒光顯示。而在移植后1月骨骼肌細胞膜開始出現(xiàn)少量抗肌萎縮蛋白表達，大約占細胞總數(shù)的10％，隨時間延長表達逐漸增多，2個月時陽性細胞數(shù)分別占細胞總數(shù)的18％，多呈簇狀分布；3個月時進一步增多，約為35％，經成肌細胞L6SkM移植后mdx鼠骨骼肌細胞在形態(tài)學上細胞大小不一，且萎縮細胞與肥大細胞鑲嵌存在，PI反染后見細胞移植后部分細胞核邊移。

2.2 免疫熒光法檢測L6SKM細胞移植后mdx鼠utrophin表達變化 正常C57BL/6鼠utrophin主要分布于神經肌肉接頭處，表達量較少，mdx鼠utrophin主要分布于肌膜下，與dystrophin的分布基本一致，在一些橫截面積較小的新生及纖維中表達尤為增強；但在實驗中發(fā)現(xiàn)仍有少數(shù)體積較大的細胞肌膜未著色，胞漿勻染，較utrophin表達量高者著色深。經成肌細胞L6SkM移植移植后1個月、2個月和3個月，utrophin的表達量有隨時間的延長呈逐漸減少趨勢，可見utrophin在神經肌肉接頭處的表達。見表1。

表1 免疫熒光法檢測L6SKM細胞移植后mdx鼠dystrophin和utrophin表達變化（ˉx±s）

2.3 Dystrophin的Western blotting表達 正常對照組C57BL/6鼠及mdx鼠的蛋白表達分別為強陽性及陰性，經L6SkM移植后1個月、2個月和3個月可見Dystrophin的表達呈逐漸增加趨勢，與免疫熒光結果基本一致。見圖1。

2.4 Utrophin的Western blotting表達 C57BL/6鼠Utrophin的表達量較少，mdx鼠表達量較C57BL/6鼠顯著增多，經L6SkM移植后1、2和3個月可見utrophin的表達呈逐漸減少趨勢，與免疫熒光結果基本一致。見圖2。

圖1 Western blotting檢測L6SkM移植后Dystrophin表達1：C57BL/6鼠；2：mdx鼠；3～5：經L6SkM移植后1月、2月和3月mdx鼠

圖2 Western blotting檢測L6SkM移植后Utrophin的表達1C57BL/6鼠；2mdx鼠；3～5經L6SkM移植后1個月、2個月和3個月mdx鼠

3 討論

成肌細胞屬于一種干細胞，具有分裂增殖的潛能，成肌細胞可以相互融合，形成終末分化的肌纖維，一般認為其在肌原細胞譜系中處于分化進程中的倒數(shù)第2位。骨骼肌的組織發(fā)生學表明，成肌細胞（又名生肌細胞，包括胚胎中的成肌細胞和成熟肌組中的衛(wèi)星細胞均為肌肉前體細胞）來源于中胚層干細胞，隨著胚胎的發(fā)育，肌母細胞分裂、融合而形成多核的骨骼肌纖維細胞。在肌管階段，有單個核細胞附著其表面，分化為衛(wèi)星細胞。成熟后衛(wèi)星細胞一般是靜止的，當肌肉受損或受其他刺激時，肌衛(wèi)星細胞變?yōu)槌杉〖毎?，進行分裂并分化為肌細胞，填補其受損部位。

本實驗用成肌細胞L6SkM給予mdx鼠進行移植后2周，mdx鼠注射肢的骨骼肌細胞未檢測到有抗肌萎縮蛋白表達，而在移植后1個月、2個月、3個月表達抗肌萎縮蛋白的肌纖維百分比分別為10.86％，18.45％和35.68％，說明移植后的成肌細胞轉化為宿主的骨骼肌細胞有一個時間過程，在轉化肌纖維表達抗肌萎縮蛋白可能需要2周以上的時間，2周以后隨時間增加表達的抗肌萎縮蛋白量增高，并能穩(wěn)定地表達3個月以上。眾多學者研究抗肌萎縮蛋白表達的持續(xù)時間不一，以Law等報道的持續(xù)時間最長，1例DMD患兒細胞移植后抗肌萎縮蛋白持續(xù)達6a，認為抗肌萎縮蛋白的表達與成肌細胞的純度、注射時的操作方法以及注射的劑量均有一定關系［6-7］。Horsley等［8］報道，通過新的信號途徑—鈣調節(jié)轉錄因子（calcium-regulated transcription factor）能夠調控成肌細胞與宿主細胞的融合，這一發(fā)現(xiàn)可能會給成肌細胞的移植研究帶來新的機遇。Smythe［9］發(fā)現(xiàn)，在MyoD裸鼠，外源的成肌細胞在移植后3個月內遷移能力呈線性增加，而在對照的Balb/c鼠，移植后1周便停止遷移，表明MyoD缺乏能夠促進外源成肌細胞與宿主的融合。

Radojevic等［10］還發(fā)現(xiàn)，分離正常人和貓的成肌細胞，然后分別與抗肌萎縮蛋白缺陷患者與貓的成肌細胞在一起培養(yǎng)，結果二者相互融合形成了雜交的肌管（hybrid myotube），這些雜交的肌管表達正常的抗肌萎縮蛋白、utrophin蛋白和抗肌萎縮蛋白關聯(lián)蛋白（dystrophin associated protein，DAP），說明正常的抗肌萎縮蛋白基因能夠恢復成肌細胞基因的正常表達。

utrophin與dystrophin在氨基酸序列上有很大同源性，分布于全身各個組織，其中以神經肌肉接頭處最多［11］，二者共同協(xié)同調控維持肌肉發(fā)育過程中肌肉正常的功能［12］。在DMD患者和mdx鼠utrophin表達上調可緩解因dystrophin缺失造成的傷害［13］，推測可能與胚胎時期肌肉發(fā)育過程相關，utrophin和dystrophin競爭性爭奪DAP結合位點。本研究結果顯示mdx鼠的utrophin在肌膜上的表達明顯多于C57BL/6鼠，說明在mdx鼠的骨骼肌中確存在utrophin表達上調，且與dystrophin的表達水平基本相反，與前述文獻報道的結果一致［11］。成肌細胞L6SkM移植后1月和2月時utrophin的表達有下降趨勢但不明顯，可能由于雖dystrophin的表達持續(xù)增加，但不足以彌補mdx鼠的骨骼肌持續(xù)進行性變性壞死所致的utrophin表達量上調；3月時utrophin的表達有明顯下降。

成肌細胞移植肌內注射的研究說明，移植后的外源性成肌細胞可以參與宿主的骨骼肌細胞的再生，與宿主細胞融合較長時間地表達抗肌萎縮蛋白，移植的成肌細胞達到一定的數(shù)量就可表達抗肌萎縮蛋白，是否能夠改善mdx鼠運動功能，還需進一步的研究。但本實驗所觀察到的結果至少說明這種移植方法可行。但在DMD患者中應用仍然面臨很多需要解決的問題，如安全的成肌細胞獲取方式，安全有效的抗免疫移植劑的使用，更加優(yōu)化的能夠改善膈肌、呼吸肌功能的細胞移植途徑與方法，移植細胞與宿主細胞長時、有效地融合并能夠改善患者的運動功能、延長壽命等。

［1］Strober JB.Therapeutics in Duchenne muscular dystrophy［J］.Neurol Res，2006，3（2）：225-234.

［2］Lorenzon P，Bernareggi A，Degasperi V，et al.Properties of primary mouse myoblasts expanded in culture［J］.Exp Cell Res，2002，278（1）：84-91.

［3］Montarras D，Morgan J，Collins C，et al.Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration［J］.Science，2005，309（5 743）：2 064-2 067.

［4］Ustanina S，Carvajal J，Rigby P，et al.The myogenic factor Myf5supports efficient skeletal muscle regeneration by enabling transient myoblast amplification［J］.Stem Cells，2007，25（8）：2 006-2 016.

［5］Deol JR，Danialou G，Larochelle N，et al.Successful compensation for dystrophin deficiency by a helper-dependent adenovirus expressing full-length utrophin［J］.Mol Ther，2007，11（5）：2 015-2 018.

［6］Partridge T.Myoblast transplantation［J］.Neuromuscul Disord，2002，12（Suppl）1：S3-6.

［7］Law PK，Goodwin TG，F(xiàn)ang Q.First human myoblast transfer therapy continues to show dystrophin after 6years［J］.Cell Transplant，1997，6（11）：95-100.

［8］Horsley V，Pavlath GK.Forming a multinucleated cell：molecules that regulate myoblast fusion［J］.Cells Tissues Organs，2004，176（1/3）：67-78.

［9］Smythe GM，Grounds MD.Absence of MyoD increases donor myoblast migration into host muscle［J］.Exp Cell Res，2001，267（2）：267-274.

［10］Radojevic V，Oppliger C，Gaschen F，et al.Restoration of dystrophin expression in cultured hybrid myotubes［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，2002，28（5）：397-409.

［11］Jasmin BJ，Angus LM，Bélanger G，et al.Multiple regulatory events controlling the expression and localization of utrophin in skeletal muscle fibers：insights into a therapeutic strategy for Duchenne muscular dystrophy［J］.J Physiol Paris，2002，96（1/2）：31-42.

［12］Roma J，Munell F，F(xiàn)argas A.Evolution of pathological changes in the gastrocnemius of the mdx mice correlate with utrophin and beta-dystroglycan expression［J］.Acta Neuropathol（Berl），2004，108（5）：443-452.

［13］Cerletti M，Negri T，Cozzi F，et al.Dystrophin phenotype of canine X-linked muscular dystrophin is mitigated by adenovirus-mediated utrophin gene transferr［J］.Gene Ther，2003，10（9）：750-757.

（收稿2014-03-14修回2014-10-07）

Effects of skeletal muscle myoblast transplantation on the dystrophin and utrophin expression in mdx rats after radiotherapy

Wang Yinlong，Shan Tieying，Pan Xiulan
The Affiliated Hospital of Hebei Engineering University，Handan056002，China

Objective To investigate the effects of skeletal muscle myoblast transplantation on the dystrophin and utrophin expression in mdx rats after radiotherapy.Methods The skeletal muscle myoblast was transplanted into mdx mice by intramuscular injection.The dystrophin and utrophin expression of limb skeletal muscle of laboratory mice were detected with immunofluorescence assay and Western blotting at 1，2and 3months after transplantation.Results The dystrophin expression level was gradually increasing but the utrophin expression level was gradually decreasing with the time extension of implantationat 1，2and 3months after transplantation.Conclusion Skeletal muscle myoblast transplantation can up-regulate the dystrophin expression level and down-regulate the utrophin expression level.

Myoblast；mdx mice；Cell transplantation；Dystrophin；Utrophin

R-332

A

1673-5110（2015）04-0004-03