葉飛++姚長宇++張欣

摘 要：從吉林市左家林地土壤中分離得到一株纖維素酶產(chǎn)生菌，由形態(tài)觀察和18S rDNA序列分析，該菌株為真菌，屬散囊菌綱（ Uncultured Eurotiomycetes），命名為JN510。該菌產(chǎn)生纖維素酶活力為2.32IU/mL，具有進(jìn)一步研究價值。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；菌種篩選；鑒定；酶活力

中圖分類號： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132001

纖維素是農(nóng)作物秸稈的主要成分之一，也是地球上含量最為豐富的可降解生物質(zhì)，其為葡萄糖聚合物，以β-1，4糖苷鍵聚合。它的降解與轉(zhuǎn)化是生物圈碳素循環(huán)與生物能傳遞的重要環(huán)節(jié)。利用微生物對纖維素進(jìn)行降解，對于自然界生物能源的利用具有重要意義。世界各國均積極開展對纖維素降解菌的研究[1]。東北地區(qū)作為我國的糧食主產(chǎn)區(qū)，每年產(chǎn)生大量富含纖維素的農(nóng)業(yè)秸稈，傳統(tǒng)的焚燒污染環(huán)境且造成大量生物質(zhì)浪費。

本試驗從吉林市左家林地土壤中分離出一株纖維素降解菌，由菌絲、菌落形態(tài)以及16S rDNA初步鑒定為散囊菌綱（ Uncultured Eurotiomycetes）。其具有較強(qiáng)纖維素酶產(chǎn)酶活性，對于纖維素的降解轉(zhuǎn)化具有積極意義，菌種具有進(jìn)一步研究價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料

土壤樣品，采自吉林省吉林市左家地區(qū)林地；化學(xué)試劑均為分析純，購于北京化學(xué)試劑廠；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自生工生物工程（上海）有限公司。Biospin凝膠回收試劑盒，購自BioFlux公司；

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：MgSO·7H2O 4 0.1g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1g， K2HPO4 1.0g， MnSO4 5×10-4g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏10.0g，水1000ml，自然pH，121℃滅菌30min。

剛果紅篩選培養(yǎng)基：KNO3 2.0g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1.0g，NaCl 1.0g，Na2HPO4 1.0g，蒸餾水500ml，加熱溶解后加入CMC-Na 20.0g、瓊脂20.0g、剛果紅0.2g充分溶解后，蒸餾水定容至1000ml，HCl調(diào)pH直至達(dá)到7.0～7.2，121℃滅菌30min，搖勻后倒平板。

纖維素鈉篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0g，蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，瓊脂12.0g，，水 1000ml，121℃滅菌30min，搖勻后到平板。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：Na2HPO4 3.0g，NH4NO3 0.8g，CaCl2 0.5g，ZnSO40.01g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.01g，CMC-Na 10.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏1.0g， 水1000ml，HCl調(diào)pH值7.0～ 7.2，121℃滅菌30min，搖勻后到平板。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，去皮切成小塊，用蒸餾水1000ml小火沸煮30min，8層紗布過濾，濾液補(bǔ)水至1000ml，調(diào)pH6.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集與菌種分離

于左家地區(qū)林地，取腐殖質(zhì)表層土壤5g土樣于三角瓶中，加入50ml無菌水，震蕩5min，至分散均勻。取5ml懸液于50ml富集培養(yǎng)基，28℃，80r/min震蕩培養(yǎng)5～7d。取富集培養(yǎng)液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀釋，涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，靜置30min后，28℃倒置培養(yǎng)，分離有明顯透明水解圈的菌落。若菌落重疊可劃線分離菌株。

1.2.2 菌株纖維素降解能力測定

將分離獲得的菌株，液體培養(yǎng)后，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5做系列稀釋后涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基，靜置30min后，28℃倒置培養(yǎng)，待菌落直徑1.0～5.0mm，取下培養(yǎng)基，于1%剛果紅溶液浸泡1h，棄去剛果紅溶液，于1mol/L NaCl溶液浸泡0.5h，棄去NaCl溶液，觀察并測量水解圈大小。

1.2.3 纖維素酶活力測定

采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸法）測定纖維素酶活力 [2]。酶活力定義為：1min內(nèi)催化纖維素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量為1IU。

1.2.4 菌株表型特征鑒定

取無菌水一滴至于干凈玻片，接種環(huán)挑取少許菌絲涂布，風(fēng)干固定，顯微觀察菌株形態(tài)。

1.2.5 菌株的18S r DNA鑒定

CTAB法提取菌株基因組DNA，分析18S r DNA進(jìn)行軍中鑒定。PCR反應(yīng)體系（50μL）：dd H2O 34.0μL，10×buffer 5.0μL，d NTP4.0μL，F(xiàn)P2μL，RP2μL，Taq酶 1μL，模板DNA 2μL。引物序列：FP 5'-ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG-3'；RP 3' –CCGATCCCTAGTCGGCATAG-5'。PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)； 72℃，10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送至英濰捷基公司測序。序列于GeneBank由BLAST進(jìn)行序列同源性分析，確定菌種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離和纖維素降解能力初步鑒定結(jié)果

由剛果紅篩選培養(yǎng)基水解圈初步判斷，實驗分離得到多種具有纖維素降解能力的菌株。其中3種疑似真菌類菌株，具有較為明顯纖維素降解能力。

取這3種菌株，于剛果紅篩選培養(yǎng)，用1%剛果紅溶液浸泡后1mol/L NaCl溶液浸泡脫色，測量水解圈大小，結(jié)果見表1。由表1可知，1號菌水解圈直徑/菌落直徑為8.8，遠(yuǎn)高于2號菌和3號菌。初步表明，1號菌具有較明顯纖維素降解能力。

2.2 菌株的纖維素酶活力測定結(jié)果

取1號菌、2號菌、3號菌，DNS法測定纖維素酶活力，結(jié)果見圖1。由圖1可知，在3種菌株中，1號菌纖維素酶活力最高，為2.32IU/mL。將1號菌命名為JN510。由纖維素酶活力判斷，其具有進(jìn)一步研究的價值。

2.3 JN510菌株表型特征鑒定結(jié)果

JN510菌株于PDA培養(yǎng)基28℃下培養(yǎng)，生長快速。3d后呈白色絨毛狀氣生菌絲；繼續(xù)培養(yǎng)，菌落轉(zhuǎn)為綠褐色；繼而顏色逐漸加深。菌落毛絨狀。鏡檢結(jié)果見圖2。

2.4 18S rDNA序列分析結(jié)果

JN510菌株基因組 DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，結(jié)果見圖3。由圖可知，引物對18S r DNA 序列擴(kuò)增效果良好，擴(kuò)增片段約500bp。

回收片段，送英濰捷基公司測序。獲得序列經(jīng)GeneBank比對，該菌種與序列號為EU368286.1的Uncultured Eurotiomycetes具有99%的親緣關(guān)系，結(jié)合文獻(xiàn)所列形態(tài)學(xué)特征的描述，將其鑒定為散囊菌綱（Uncultured Eurotiomycetes）[3，4]。

3 討論

吉林市左家地區(qū)林地腐殖質(zhì)表層土壤中存在大量可以降解纖維素的纖維素酶產(chǎn)生菌。其可應(yīng)用于生物化工過程，如秸稈發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇等工藝。這些菌對于富含纖維素的的轉(zhuǎn)化利用以及農(nóng)業(yè)秸稈回收利用具有重要意義。

纖維素酶包括β-葡萄糖苷酶、內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶。3者協(xié)同作用降解纖維素生成葡萄糖。不同菌種產(chǎn)生上述3種酶的濃度與活力不同。雖然自然界中纖維素降解菌種類較多，但是秸稈等生物質(zhì)中的纖維素往往與木質(zhì)素、脂質(zhì)等交聯(lián)存在。使得自然界中纖維素降解菌的降解能力不理想，降低了秸稈等富含纖維素生物質(zhì)的開發(fā)利用。因此可以考慮構(gòu)建不同纖維素降解菌，以及纖維素降解菌與木質(zhì)素降解菌等降解菌的混合菌系。以此來轉(zhuǎn)化纖維素，提高降解效率。

本實驗獲得的纖維素降解菌JN510具有較強(qiáng)纖維素降解能力，具有良好的開發(fā)前景，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]頓寶慶，吳薇，王旭靜，等.一株高纖維素酶活力纖維素分解菌的分離與鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2008，10（1）：113-117.

[2] Ghose TK. Measurement of cellulase activities[J]. Pure Appl Chem， 1987， 59（2）： 257- 268.

[3] 魏景超. 真菌鑒定手冊[M]. 上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：129-135.

[4] 戴芳瀾. 中國真菌總匯[M]. 北京： 科學(xué)出版社，1979：1527.

作者簡介：葉飛（1978-），男，副教授，主要從事應(yīng)用微生物學(xué)研究。