丁 苗，李成龍，劉淑貞，周才瓊

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

自然乳酸發(fā)酵 豬肉蛋白質降解與血管緊張素轉化酶抑制肽的分離純化

丁 苗，李成龍，劉淑貞，周才瓊*

（西南大學食品科學學院，重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶 400715）

對豬肉發(fā)酵過程中蛋白質及其降解產物進行分析。結果表明：豬肉在發(fā)酵過程中蛋白氮含量隨發(fā)酵時間延長呈下降趨勢，非蛋白氮和氨態(tài)氮含量隨發(fā)酵時間的延長而增加，多肽氮含量呈先升高后降低趨勢，在發(fā)酵20 d時達最大值（0.227%）；發(fā)酵20 d酸肉多肽具有最強的體外血管緊張素轉化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制活性，ACE抑制率達74.35%，IC50為2.75 mg/mL；采用超濾、D101型大孔樹脂、葡聚糖凝膠對發(fā)酵20 d的酸肉多肽進行分離純化，分離得到的F3組分有較強的ACE抑制活性，IC50為0.90 mg/mL，肽含量為86.5 4%，氨基酸組成分析顯示水解后增加最多的氨基酸是脯氨酸（7.08 倍）和酪氨酸（3.26 倍），谷氨酸、組氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸占全部肽中氨基酸總量的49.09%，構成肽的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸分別占39.35%、10.69%和13.65%；反相高效液相色譜顯示F3組分主要由9 個峰組成，有待進一步的純化。

豬肉；乳酸發(fā)酵；蛋白質降解；血管緊張素轉化酶抑制肽；分離純化

高血壓是一種嚴重危害人類健康的疾病，在世界范圍內約有45%心血管疾病的發(fā)生和死亡與之相關[1]。血管緊張素轉化酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）是調節(jié)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system， RAS）和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（kallikrein-kinin system，KKS）的關鍵酶，能作用于血管緊張素I和緩激肽，產生血管收縮活性，引起血壓升高[2]。抑制ACE活性對降低血壓有積極的影響，長期服用合成的降血壓藥物如卡托普利、依那普利等通常伴隨有干咳、味覺干擾、皮疹、器官障礙等副作用[3]，食源性ACE抑制肽因其天然來源、無副作用、更為安全而受到青睞。目前研究者已經從植物蛋白[4]、動物蛋白[5]、藻類蛋白[6]等的酶解產物和奶酪[7]、腐乳[8]等發(fā)酵制品中分離得到了各種不同結構的ACE抑制肽。

豬肉是我國居民食用廣泛的肉類食品，有研究表明，來自香腸的植物乳桿菌分泌的蛋白酶和氨肽酶可以水解肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，產生肽和氨基酸[9]；豬骨骼肌蛋白經蛋白酶水解后會有多種具有不同ACE抑制活性的肽片段被釋放[10]，Escudero等[11]從發(fā)酵肉制品西班牙干腌火腿中分離出了具有體外ACE抑制活性的肽，能夠顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的收縮壓。中國傳統(tǒng)酸肉是以新鮮豬肉為原料，加入米粉、鹽等，在自然狀態(tài)下利用微生物進行厭氧發(fā)酵而成的一類乳酸菌發(fā)酵肉制品，主要存在于重慶、貴州、湖南、廣西等地[12]。目前關于其功能性成分研究少見報道，葉春等[13]對酸肉中的肽進行了提取，研究了其抗氧化活性，結果表明酸肉肽對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、亞硝酸鹽有良好的清除能力。本研究擬對酸肉發(fā)酵過程中蛋白質降解及ACE抑制肽的形成進行研究，采用現代分離純化技術對發(fā)酵酸肉中的ACE抑制肽進行分離純化，為酸肉制品的開發(fā)提供有關功能化學的研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食鹽、粳米、新鮮豬后腿瘦肉，購自重慶市北碚區(qū)天生路永輝超市。

酸肉制作：取新鮮豬后腿瘦肉，洗凈并瀝干水分，切成薄塊（3 cm×5 cm×1 cm）、加入食鹽（5%）和炒至金黃的粳米磨成的細粉（10%）、揉制裝壇、水密封，于10～20 ℃條件下發(fā)酵。

硼酸、四硼酸鈉、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙醇、D101型大孔樹脂、考馬斯亮藍G-250（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠；牛血清白蛋白（生化試劑） 北京奧博星生物技術有責任限公司；卡托普利片 山西云鵬制藥有限公司；馬尿酸、Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準品、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（Hip-His-Leu，HHL） 美國Sigma公司；氧化型谷胱甘肽、透析袋 北京索萊寶公司；Sephadex G-50 美國Pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

KjelFlex K-360全自動凱氏定氮儀 瑞士Büchi公司；DZF-6020真空干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司；LC-20A高效液相色譜儀、UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；1-15PK冷凍離心機 德國Sigma公司；RE-52A真空旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；MSC050超濾杯（配30、10 kD超濾膜） 上海摩速科學器材有限公司；FSH-2型可調高速勻漿器 江蘇大地自動化儀器廠；HL-2恒流泵、DBS-100電腦全自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；日立L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本Hitach儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵酸肉中粗肽的提取

按照Escuderoa等[14]的方法進行，取不同發(fā)酵時間的酸肉，剔除可見的脂肪和筋膜，用生理鹽水洗去脂肪，切碎后稱取50 g放入三角瓶中，加入200 mL 0.01 mol/L 的HCl溶液，高速均漿4 次（22 000 r/min，每次10 s，間隔10 s），然后置于4 ℃冷凍離心機中10 000 r/min離心20 min，取上清液過濾，加入3 倍體積40%的乙醇以脫去蛋白質，4 ℃條件下放置20 h，再次4 ℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液在旋轉蒸發(fā)儀中濃縮后經真空冷凍干燥制成粗肽粉，于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血管緊張素轉化酶的粗提及驗證

參照吳瓊英等[15]的方法，將從市場上購買的新鮮豬肺放置于冰箱中于4 ℃條件下約12 h，充分冷卻，然后用4 ℃預冷的質量分數0.9%的NaCl溶液沖洗干凈，除去脂肪及大血管，切成小塊。稱取100 g豬肺組織加入500 mL事先4 ℃預冷的pH 8.3、0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（含0.3 mol/L NaCl）中，高速組織搗碎機均漿2 min，將漿液置于冰箱中冷藏5 h，使浸提物充分溶解，于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液；在冰浴條件下以邊加邊攪拌的方式緩慢向上清液中加入固體硫酸銨至35%飽和度，在冰箱中4 ℃靜置5 h，然后于4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，取上清液；再向上清液中加入固體硫酸銨至55%飽和度，放置在冰箱中4 ℃靜置過夜，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀以4 ℃預冷的pH 8.3、0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液溶解，然后將溶解液裝入截留分子質量為8 000～14 000 D的透析袋中，用硼酸鹽緩沖液作透析液，4 ℃透析24 h，透析期間更換4 次透析液，以質量分數10%的BaCl2為檢測液，直至透析液中無存在，取透析后的ACE粗酶液，經真空冷凍干燥制成酶粉后于－20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

ACE的驗證：在ACE樣品中加入血管緊張素轉換酶抑制劑卡托普利（captopril），計算馬尿酸生成量的變化。

酶活力單位定義為在37 ℃的條件下，催化生成1 μmol馬尿酸所需的酶量為1 個酶活力單位（U/mg solid）；比活力定義為每毫克蛋白質所具有的酶活力（U/mg pro）。

1.3.3 酸肉肽ACE抑制活性的測定

采用Cushman等[16]的方法，對照組以同體積硼酸鹽緩沖溶液代替抑制劑，空白組為在反應前加入250 μL 1.0 mol/L的HCl溶液終止反應，其他操作與實驗組完全相同。

式中：A1為反應中ACE和樣品同時存在時的吸光度；A2為ACE和HHL空白反應（在反應前就加入250 μL 1.0 mol/L的HCl溶液終止反應）的吸光度；A3為以同體積硼酸鹽緩沖溶液代替樣品時對照組的吸光度。

半抑制濃度（IC50）測定：稱取一定質量樣品配成不同質量濃度的溶液，按照ACE抑制活性體外測定方法測定其抑制活性，采用SPSS軟件的概率系統(tǒng)（Probit）分析獲得其IC50值。

1.3.4 酸肉中ACE抑制肽的分離純化

取經冷凍干燥后的不同發(fā)酵時段酸肉粗肽粉末溶于純水，配成質量濃度為10 mg/mL的溶液，分別測定其ACE抑制率，對具有最高ACE抑制率的酸肉肽進行分離純化。

1.3.4.1 超濾

將粗肽粉溶于純水配成質量濃度為50 mg/mL的溶液，經過孔徑為10 μm的微孔濾膜過濾以除去雜質，然后注入超濾杯中，使其先通過截留分子質量為30 kD超濾膜，獲得兩種不同分子質量的組分，然后將分子質量＜30 kD的組分通過10 kD超濾膜再進行分離，操作壓力0.2 MPa，操作溫度為室溫。分別收集各分離液，獲得3 種不同分子質量的組分：Ⅰ（M＞30 kD）、Ⅱ（10 kD＜M＜30 kD）、Ⅲ（M＜10 kD）。將超濾后的各組分溶液預凍后經真空冷凍干燥制成粉末，－20 ℃條件下保存?zhèn)溆?，分別測定其體外ACE抑制活性。

1.3.4.2 大孔樹脂吸附脫鹽[17]

采用濕法上柱方法將處理好的D101型大孔樹脂裝入規(guī)格為2.5 cm×50 cm的玻璃層析柱，在室溫條件下將具有最高抑制活性的超濾組分緩慢上樣，恒流泵控制流速為0.5 mL/min，上樣質量濃度10 mg/mL，上樣量30 mL。上樣結束后分別用25%、50%、75%、90%的乙醇溶液以2.0 mL/min的流速進行洗脫，每個試管收集5 mL，用紫外分光光度計于220 nm波長處檢測收集液的吸光度，以A220 nm=0.05為透過點，當A220 nm≤0.05時停止洗脫，收集各試管中的溶液，旋轉蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥，獲得4 種洗脫組分，分別測定各組分的ACE抑制率。

1.3.4.3 葡聚糖凝膠層析

稱取Sephadex G-50凝膠干粉放入燒杯中，加入適量超純水，室溫條件下充分溶脹24 h后裝入凝膠層析柱（2.6 cm×30 cm），使用超純水平衡3 h。稱取一定量多肽樣品溶于超純水，配成質量濃度為50 mg/mL溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾后取3 mL溶液上柱，以超純水為洗脫液，恒流泵控制洗脫流速為0.8 mL/min，洗脫組分分管收集，每管收集5 min，檢測波長214 n m，重復上樣，對相應管號的洗脫組分進行合并，經旋轉蒸發(fā)儀濃縮后冷凍干燥，分別測定各組分峰的ACE抑制率。

1.3.4.4 反相高效液相色譜分離

將Sephadex G-50凝膠層析分離得到的高活性組分，經過冷凍干燥后用超純水配成10 mg/mL溶液，利用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）分離酸肉ACE抑制肽。色譜條件：Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；進樣量：10 μL；流速：0.8 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：35 ℃；流動相：A液為超純水，B液為乙腈；流動相A和B事先用0.45 μm的濾膜過濾，洗脫條件如下：0～5 min，10% B；5～10 min，10%～30% B；10～15 min，30%～60% B；15～20 min，60%～30% B；20～25 min，30%～10% B；25～30 min，10%～0% B。

1.3.5 氨基酸組成分析

根據GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》測定氨基酸組成。

1.3.6 理化分析

蛋白質含量測定：考馬斯亮藍法[18]；蛋白氮含量測定：GB 5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法；多肽氮含量測定：常量雙縮脲法，以氧化型谷胱甘肽繪制標準曲線[19]；氨基酸態(tài)氮含量測定：茚三酮比色法，以甘氨酸標準液繪制標準曲線[19]；肽含量測定：雙縮脲法，以Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準品繪制標準曲線[20]；NaCl含量測定：GB/T 12457-2008《食品中氯化鈉的測定》；非蛋白氮含量測定：按照Caieri等[21]的方法，采用凱氏定氮法測定。

2 結果與分析

2.1 酸肉發(fā)酵過程中蛋白質及其降解產物分析

圖1 酸肉發(fā)酵過程中蛋白氮、非蛋白氮含量變化Fig.1 Changes in protein nitrogen and non-protein nitrogen contents during sour meat fermentation

圖2 酸肉發(fā)酵過程中多肽氮、氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.2 Changes in peptide nitrogen and amino acid nitrogen contents during sour meat fermentation

由圖1可知，酸肉中蛋白氮含量隨發(fā)酵時間延長呈下降趨勢，由發(fā)酵0 d的3.64%下降到發(fā)酵60 d的2.135%，下降了41.35%，在發(fā)酵前期（＜20 d）、中期（20～40 d）和后期（40～60 d）分別下降了13.46%、14.44%、20.78%；非蛋白氮含量隨發(fā)酵時間延長逐漸增加，由發(fā)酵0 d的1.064%增加到發(fā)酵60 d的2.31%。由圖2可知，多肽氮含量在發(fā)酵過程中呈先增后降的趨勢，在發(fā)酵20 d時達最大值（0.227%），增加了0.207%；氨基酸態(tài)氮含量呈增加趨勢，發(fā)酵后期增加迅速，發(fā)酵60 d時含量達最高為0.262%，是發(fā)酵0 d時的7.99 倍。結果表明，發(fā)酵過程中非蛋白氮的持續(xù)增加主要源于氨基酸肽氮的增加，這與酸肉特有風味形成有關。

2.2 不同發(fā)酵時間發(fā)酵酸肉中ACE抑制肽粗肽的提取結果

2.2.1 ACE粗提及驗證結果

采用豬肺作為ACE提取材料，經測定提取的ACE活力為0.509 4 U/mg solid，比活力為7.848 U/mg pro。與未加ACE抑制劑卡托普利的實驗組相比，卡托普利組產生的馬尿酸的量明顯減少，質量濃度為6.25 mg/mL的卡托普利藥片對ACE抑制率達69.65%，表明從豬肺中提取的物質確實是ACE（表1）。

表1 ACE的粗提及驗證結果Table 1 Extraction and verifi cation of crude ACE

2.2.2 ACE抑制肽粗肽的提取結果

表2 酸肉粗肽得率及ACE抑制率的IICC5500Table 2 Yield of crude peptide from sour meat and its IC50 for ACE inhibition

由表2可知，發(fā)酵20 d酸肉ACE抑制肽粗肽提取率最高，達1.630%。將提取的多肽分別配成質量濃度為10 mg/mL的溶液，測定其體外ACE抑制率，結果見圖3。發(fā)酵0 d粗肽抑制率僅1.40%，發(fā)酵20 d和40 d的酸肉粗肽ACE抑制率分別為74.35%和64.10%，均表現出較高的體外ACE抑制活性，顯著高于發(fā)酵60 d酸肉粗肽41.61%的抑制率（P＜0.05）。4 種粗肽ACE抑制率的IC50以發(fā)酵20 d酸肉最低為2.75 mg/mL，低于發(fā)酵40 d和發(fā)酵60 d酸肉粗肽（表2）。

圖3 不同發(fā)酵時間酸肉粗肽的ACE抑制率Fig.3 ACE inhibitory rates of peptide derived from sour meat with different fermentation times

對不同發(fā)酵時段多肽氮含量變化與粗肽得率和ACE抑制率的IC50進行相關性分析，多肽氮含量變化與粗肽得率之間存在極顯著正相關（P＜0.01），與ACE抑制率的IC50為負相關（P＞0.05）。

2.3 自然乳酸發(fā)酵酸肉中ACE抑制肽的分離純化結果

2.3.1 超濾結果

將從發(fā)酵20 d酸肉中提取的粗肽通過超濾得到3 種不同分子質量范圍的超濾組分，分別配成質量濃度為2 mg/mL溶液，測定各組分ACE抑制率，結果見表3。超濾組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的ACE抑制率分別為25.80%、34.72%、53.22%，相比較超濾原液43.92%的ACE抑制率，分子質量＜10 kD的超濾組分Ⅲ的ACE抑制活性最強，比超濾原液提高了21.17%，IC50也由超濾前的2.75 mg/mL降到2.19 mg/mL，表明豬肉發(fā)酵中產生的ACE抑制肽主要是分子質量＜10 kD的一些肽類。

表3 不同超濾組分的ACE抑制率及IC50Table 3 ACE inhibitory rates and IC5500of different ultrafi ltration components

取適量超濾組分Ⅲ進行紫外全波長掃描，結果見圖4，超濾組分Ⅲ在220 nm波長附近（217 nm）有最大吸收峰，符合多肽肽鍵的特征吸收；在248.4 nm波長處也有吸收峰，推測超濾組分Ⅲ可能含有苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）。

圖4 分子質量＜10 kD超濾組分的紫外吸收光譜Fig.4 Ultraviolet absorbance spectra of the fractions with molecular weights less than 10 kD

2.3.2 D101型大孔樹脂吸附脫鹽結果

由于酸肉在制作時加入了一定量的食鹽，而過多的NaCl會影響ACE的活性，進一步實驗分別采用25%、50%、75%、90%的乙醇對超濾后分子質量＜10 kD的組分進行洗脫，收集洗脫后的各流出液，測定ACE抑制率，結果見表4。25%乙醇洗脫后的組分較洗脫前組分ACE抑制率有所降低，50%、75%、90%乙醇洗脫組分的ACE抑制率均比洗脫前高，但是50%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性升高不明顯，與洗脫前組分無顯著差異（P＞0.05），75%、90%乙醇洗脫組分的ACE抑制活性升高明顯，4 種不同體積分數乙醇洗脫后組分的ACE抑制率之間存在顯著性差異（P＜0.05）。其中75%乙醇洗脫組分的體外ACE抑制率達68.14%，是4 種不同體積分數乙醇洗脫組分中最高的，比洗脫前升高了28.03%，脫氯率為74.14%，IC50由脫鹽前的2.19 mg/mL降為1.40 mg/mL。洗脫后ACE抑制活性升高與氯離子濃度的降低有關，可能還與不同體積分數乙醇洗脫后組分的疏水值變化有關。

表4 不同體積分數乙醇洗脫組分的ACE抑制率Table 4 ACE inhibitory rates of fractions eluted by different volume fractions of ethanol

2.3.3 葡聚糖凝膠層析結果

將D101型大孔樹脂吸附，75%乙醇洗脫組分采用Sephadex G-50凝膠層析進行進一步分離純化，結果如圖5所示。75%乙醇洗脫組分經過Sephadex G-50凝膠層析后又分為4 個組分，依次命名為F1、F2、F3、F4，分別測定其體外ACE抑制活性及肽含量，結果如表5所示，F1組分的ACE抑制率最低，F3組分的ACE抑制率最高，達59.18%，IC50由D101型大孔樹脂吸附，75%乙醇洗脫后的1.40 mg/mL降為0.90 mg/mL，肽含量為86.54%，表明F3組分的主要成分是肽類物質。

圖5 Sephadex G-50層析分離結果Fig.5 Sephadex G-50 chromatography

表5 Sephadex G-50分離組分的ACE抑制率及肽含量Table 5 Peptide content and ACE inhibitory rate of each fraction separated by Sephadex G-50 chromatography

2.3.4 反相高效液相色譜分離結果

將經過葡聚糖凝膠層析得到的F3組分配成質量濃度為10 mg/mL的溶液，采用RP-HPLC進行分離，結果如圖6所示。F3組分經分離后，出現9 個洗脫峰，表明經Sephadex G-50凝膠層析得到的F3組分不是很純。

圖6 RP-HPLC分離F3組分圖譜Fig.6 RP-HPLC profi le of fraction F3

2.3.5 氨基酸組成分析

對F3組分中游離氨基酸和水解后的氨基酸組成進行測定，結果如表6所示。F3組分中游離氨基酸和水解后的氨基酸均有17 種，富含7 種必需氨基酸。水解后的各氨基酸含量和氨基酸總量均比未經水解的要高很多，這表明F3的主要成分是肽。由表6可知，水解后的氨基酸總量是水解前氨基酸總量的4.2 倍，表明分離純化的F3主要是10 kD以下的肽，有少量游離氨基酸，其中，相比水解前含量增加最多的為谷氨酸、組氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸，分別占總肽氨基酸比例為15.29%、11.34%、8.11%、7.46%和6.89%，共占全部肽氨基酸總量的49.09%。谷氨酸能促進腦細胞呼吸，利于腦組織中氨的排除，這會對血壓造成一定的影響[22]；從氨基酸增加比例看，組氨酸、賴氨酸和半胱氨酸含量分別增加了17.68、14.87和11.45 倍；疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸總量比水解前分別增加了1.92、2.24和1.79 倍，其中增加最多的氨基酸分別是脯氨酸（7.08 倍）和酪氨酸（3.26 倍）。構成肽的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸的量分別占氨基酸總量的39.35%、10.69%和13.65%，這符合ACE抑制肽一般具有疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸含量較高及亮氨酸、脯氨酸含量高的結構特點[23-24]。

表6 F3組分的氨基酸組成與含量分析Table 6 Analysis of amino acid composition and contents in fraction F3 mg/100 g

3 結論與討論

肉制品在發(fā)酵過程中在微生物胞外蛋白酶和肌肉中存在的內源蛋白酶如組織蛋白酶、鈣激活中性蛋白酶等作用下發(fā)生水解，產生多肽和寡肽以及游離氨基酸等[25]。先前的研究顯示酸肉在發(fā)酵過程中蛋白質發(fā)生了降解，其中肌原纖維蛋白和肌漿蛋白含量在發(fā)酵前期（＜20 d）迅速降低，在發(fā)酵中后期（20～60 d）下降趨緩[26]；此外，酸肉發(fā)酵過程中有大量乳酸菌生長，其中在發(fā)酵前中期乳酸菌數量多于發(fā)酵后期，乳桿菌屬和片球菌屬作為優(yōu)勢菌株貫穿整個發(fā)酵過程[27]。乳酸菌可通過其產生的胞外蛋白酶水解食品中的蛋白質，產生具有ACE抑制活性的肽片段，乳酸菌發(fā)酵食品被認為可能具有潛在的降血壓活性[28]。Castellano等[29]分別用彎曲乳桿菌CRL705和乳桿菌CRL1862發(fā)酵豬肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，發(fā)現這兩種乳酸菌均能發(fā)酵肌漿蛋白產生ACE抑制肽，從中分離出的氨基酸序列為Phe-Ile-Ser-Asn-His-Ala-Tyr的肽具有較強的ACE抑制活性。

王宇[28]的研究表明ACE抑制活性高的乳酸菌的共同特點是生長性能良好、產酸能力和蛋白水解能力都很強。而酸肉在發(fā)酵的前中期乳酸菌處于優(yōu)勢地位，生長繁殖活躍，能更多分泌胞外蛋白酶，本研究以自然乳酸發(fā)酵豬肉不同發(fā)酵時段ACE抑制活性為評價標準，結果顯示發(fā)酵20 d的酸肉粗肽體外ACE抑制活性強于發(fā)酵40 d 和60 d的酸肉粗肽，IC50為2.75 mg/mL，進一步采用超濾、大孔樹脂、葡聚糖凝膠層析等對發(fā)酵20 d酸肉ACE抑制肽粗肽進行分離純化，得到具有較強的ACE抑制活性，分子質量低于10 kD的F3組分，其肽含量為86.54%， IC50為0.90 mg/mL，主要由9 個峰組成，經對F3組分氨基酸組成進行分析，發(fā)現其主要由Glu、Phe、His、Asp和Ala組成，占全部肽氨基酸總量的49.09%，含較多的疏水性氨基酸、芳香族氨基酸和支鏈氨基酸，符合ACE抑制肽的一般結構特點，進一步的實驗擬進行深入研究，確定ACE抑制肽的結構和組成。

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Protein Degradation and Purifi cation of ACE Inhibitory Peptides from Pork Naturally Fermented by Lactic Acid Bacteria

DING Miao, LI Chenglong, LIU Shuzhen, ZHOU Caiqiong*
(Chongqing Engineering Research Center of Regional Food, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

The contents of protein and its degradation products were analyzed during the natural fermentation of pork by lactic acid bacteria. The results indicated that with the extension of fermentation time, the content of protein nitrogen decreased, non-protein nitrogen and amino acid nitrogen increased, and peptide nitrogen showed a downward trend after an initial increase to the maximum level (226.5 mg/100 g) during fermentation for approximately 20 days. Peptides derived from sour meat fermentation for 20 days exhibited the highest ACE inhibitory activity in vitro. ACE inhibitory rate was 74.35%, with an IC50value of 2.75 mg/mL. Ultrafi ltration and D101 macroporous resin and gel fi ltration chromatography were carried out sequentially for the purification of ACE inhibitory peptides. Fraction F3 had a strong ACE inhibitory activity with IC50value of 0.90 mg/mL, and the content of peptides was 86.54%. Amino acid composition analysis showed that most signifi cantly increased levels of amino acids after hydrolysis were observed for proline (7.08-fold) and tyrosine (3.26-fold), and glutamic acid, histidine, aspartic acid, phenylalanine and alanine together accounted for 49.09% of the total amino acids in peptides. Hydrophobic amino acids, aromatic amino acids and branched-chain amino acids in peptides accounted for 39.35%, 10.69% and 13.65%, respectively. RP-HPLC showed that F3 was mainly composed of nine peaks thus needing further purifi cation.

pork; lactic acid fermentation; protein degradation; ACE inhibitory peptide; separation and purifi cation

TS201

A

1002-6630（2015）19-0204-07

10.7506/spkx1002-6630-201519037

2014-11-30

重慶市特色食品工程技術研究中心能力提升項目（cstc2014pt-gc8001）

丁苗（1988-），男，碩士研究生，研究方向為食品化學與營養(yǎng)學。E-mail：dsky1213@163.com

*通信作者：周才瓊（1964-），女，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)化學。E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn