王麗然 李書國

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

聚L－天冬氨酸／多壁碳納米管修飾電極法快速測定麥麩中的酚酸

王麗然 李書國

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）

研究了電聚合法結(jié)合吸附法制備聚L－天冬氨酸／多壁碳納米管修飾電極及其對酚酸類物質(zhì)的電化學(xué)催化作用及機理，建立了一種快速測定小麥麩皮中酚酸的新方法。在pH 3.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸溶液組成的電解質(zhì)溶液中，該納米修飾電極對沒食子酸氧化有顯著的電催化作用，沒食子酸在電極上的氧化動力學(xué)過程為吸附控制過程；沒食子酸在該納米修飾電極上的氧化電流與其濃度在2×10－6～5.6×10－5mol／L范圍具有良好的線性關(guān)系，最低檢測限為7.6×10－7mol／L。利用該法測定了小麥麩皮中酚酸含量，其結(jié)果為（1 130.8±4.50）μg／g，與 Folin－Ciocalteu比色法的測定結(jié)果（1 180.7±8.18）μg／g一致，且具有簡便、快速、靈敏的優(yōu)點，所需化學(xué)試劑較少。

酚酸 納米修飾電極 麥麩 快速測定

酚類化合物苯環(huán)上的羥基極易失去氫電子，故酚類化合物作為良好的電子供應(yīng)體而發(fā)揮抗氧化功能［1－2］。酚酸是酚類物質(zhì)中的一類，多為肉桂酸和苯甲酸的羥化衍生物［3］。前者通常與奎尼酸或葡萄糖酯化存在于食物中，主要有肉桂酸、咖啡酸和阿魏酸［4］。后者主要以配糖物的形式存在于食物中，最常見的有羥基苯甲酸、香草酸和沒食子酸［5］。存在于植物源食品中的酚酸占總酚酸的1／3，而小麥麩皮是植物酚酸的重要資源。我國每年小麥麩皮產(chǎn)量在2 000萬t以上，目前其主要用于添加到飼料中，經(jīng)濟利用價值極低［6］。根據(jù)存在的形式，麩皮中的酚酸可分為可溶性和束縛型2種。而大多數(shù)的酚酸是以后者的形式存在［3］。近年來，酚酸作為抵抗癌癥和心臟病的潛在保護因子，受到越來越多的關(guān)注，其價值急劇提高。美國膳食營養(yǎng)學(xué)家也提倡全谷物食品的攝入量應(yīng)達(dá)到每天3次，每次約100 g［2］。因此通過飲食攝入一定水平的酚酸對人體健康是有益的，而不同的谷物所含酚酸的種類和含量不同，快速測定谷物中酚酸的含量對指導(dǎo)科學(xué)飲食具有重要意義。

目前酚酸的分析測定方法有高效液相色譜法［7］、福林酚法［8］和毛細(xì)管電泳法［9］等。國內(nèi)關(guān)于小麥麩皮中束縛型酚酸的電化學(xué)檢測的報道很少。本試驗研究了poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極的制備及其對酚酸的電催化作用，建立了一種谷物中酚酸的快速檢測新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

L－天冬氨酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；多壁碳納米管（MultiWalled Carbon Nanotubes，MWCNTs，8－15 nm，50μm，＞95%：北京德科島金；麩皮（石優(yōu)17號小麥）：河北黑馬糧油工業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

LK98BⅡ型微機電化學(xué)分析系統(tǒng)：天津蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司；三電極系統(tǒng)（3 mm玻碳圓盤電極為工作電極、鉑絲電極為對電極、Ag／AgCl電極為參比電極）、電解杯：上海CHI儀器公司。

1.3 修飾電極的制備

1.3.1 電極的預(yù)處理

玻碳電極在使用前依次用1.0、0.3、0.05μm Al2O3粉拋光成鏡面，用超純水沖洗，再分別用 HNO3∶H2O＝1∶1（V／V）、乙醇、超純水各超聲清洗 30 s，除去表面吸附物；然后置于0.5 mol／L硫酸溶液中用循環(huán)伏安法掃描約10 min，掃描速度為50 mV／s，電壓范圍為－1.0～1.0 V，得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖后，取出，用超純水洗凈，用氮氣干燥后備用。

1.3.2 修飾電極的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g未純化的MWCNTs于30 mL濃硝酸中，在磁力攪拌器下攪拌7 h后，再超聲振蕩分散2 h后，用超純水洗至中性，置于烘箱中烘干，待用。稱取0.01 g酸化后的MWCNTs樣品，加入到10 mLN，N－二甲基甲酰胺中，然后超聲分散30 min，形成1.0 g／L黑色懸濁液（此溶液至少可穩(wěn)定30 d）。

稱取一定量L－天冬氨酸置于磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液（pH＝6.0）中配制 2.0×10－3mol／L的L－天冬氨酸溶液。以預(yù)處理后的玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag／AgCl電極為參比電極放入該溶液中，在 －1.20～1.60 V（vs.Ag／AgCl）之間以100 mV／s的掃速循環(huán)掃描15圈，取出，超純水沖洗，再用微量移液器取5μL上述MWCNTs分散液滴加在已修飾聚合物膜的電極表面，室溫下干燥，即制得 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極。

1.4 麥麩中酚酸的檢測

1.4.1 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極法測定酚酸

將制備好的電極置于5 mL pH 3的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液中，用循環(huán)伏安法研究了GA在不同條件下在修飾電極上的電化學(xué)行為（在0.0～0.8 V區(qū)間以50 mV／s循環(huán)掃描至穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線）；用微分脈沖伏安法研究了GA氧化峰電流與其濃度的線性關(guān)系及檢出限（設(shè)定初始電位0.0 V，終止電位1.0 V，電位增量0.001 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖寬度0.05 s，脈沖間隔0.3 s，等待時間 5 s）；以標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定了小麥麩皮中束縛型酚酸的含量（根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酚酸的GA當(dāng)量）。每次掃描后，將電極置于 pH＝3的磷酸氫二鈉－檸檬酸空白溶液中循環(huán)掃描至無峰出現(xiàn)，消除吸附在電極表面的酚酸，電極即可復(fù)用。

1.4.2 Folin－Ciocalteu比色法

谷物中的酚酸是一類混合物，酚酸在不同定量分析方法上存在著一定的區(qū)別，已報道的有關(guān)酚酸的測定大多數(shù)是采用 Folin－Ciocalteu比色法［10］。本試驗采用Folin－Ciocalteu比色法測定谷物中束縛型酚酸的總含量。

Folin－Ciocalteu試劑的配制：稱取100 g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）和25 g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O），將兩者溶解于700 mL水中，倒入2 L的圓底燒瓶中，加入50 mL 85%磷酸和100 mL濃鹽酸，放入幾粒玻璃珠，給燒瓶上連續(xù)回流冷凝器，用文火回流10 h（可不連續(xù)）?；亓骱笥?0 mL蒸餾水沖洗冷凝管上的附著物，然后取下。加150 g硫酸鋰（LiSO4·2H2O）和幾滴溴水（邊加邊搖）至金黃色，加熱沸騰15 min，去除殘余溴，用水稀釋至1 000 mL，過濾，濾液成微綠色，置于棕色瓶中在冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

精確吸取0.5 mL待測溶液于比色管中，再分別吸取0.8 mol／L的 Folin－Ciocalteu試劑 0.75 mL，10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的Na2CO3溶液1.5 mL，蒸餾水定容至10 mL，在35℃溫度下水浴一定時間后測定其在740 nm吸收波長下的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定束縛型酚酸的GA當(dāng)量。

1.5 檢測樣品的處理

面粉加工副產(chǎn)物－小麥麩皮樣品經(jīng)粉碎后，取粒徑直徑為250～380μm之間的部分，以料液比為1∶20（m／V）正己烷脫脂，磁力攪拌 1 h，抽濾后殘渣室溫下陰干。取0.5 g脫脂麩皮，用40 mL的2 mol／L的NaOH溶液堿解18 h，于室溫條件下5 000 r／min離心10 min，上清液調(diào)pH 3。殘渣用40 mL的6 mol／L的 HCl溶液于沸水中酸解 1 h，冷卻至室溫5 000 r／min離心10 min，上清液調(diào) pH 3。合并2次所得上清液中室溫下避光保存待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 GA在 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE的電化學(xué)行為

利用循環(huán)伏安法分別記錄了2.4×10－4mol／L的GA在裸玻碳電極，poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極上的伏安圖，如圖1所示。由圖1可見，裸玻碳電極在空白溶液（a）中無峰出現(xiàn)，而在加入GA的溶液（b）中有一個小的氧化峰，說明GA在電極的表面被氧化。GA的電化學(xué)氧化方程：

如圖1（c），poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極能夠使GA的氧化峰電流增大，峰形改善且氧化峰電位正移至0.475 V。這歸因于電極表面電聚合L－天冬氨酸產(chǎn)生的陽離子自由基和MWCNTs。玻碳電極上的C原子與自由基中的N共價結(jié)合，形成穩(wěn)定的聚合膜。而聚合膜中含有大量的羧基，它與GA中羥基形成氫鍵。而MWCNTs具有大的比表面積和強的吸附能力，對GA有良好的吸附作用，從而提高氧化峰的電流。需要指出的是，GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極上的背景電流顯著增大，是MWCNTs修飾電極在修飾過程中所用的分散劑N，N－二甲基甲酰胺在電極表面覆蓋所致。

圖1 GA在不同電極上的循環(huán)伏安圖

2.2 掃描速度對GA伏安行為的影響

圖2是在濃度為8.0×10－5mol／L的 GA溶液中，利用循環(huán)伏安法研究了掃描速度在10～130 mV／s范圍內(nèi)（由內(nèi)向外，掃速增大）對GA伏安行為的影響，隨掃描速度的增大，GA的氧化峰電流逐漸增大，氧化峰電位逐漸正移。氧化峰電流（Ipa）與掃描速率（v）呈良好的線性關(guān)系，回歸方程是Ipa＝0.015 7v＋1.883 3（Ipa單位為 μA，v單位為mV／s），R2＝0.995 4。這說明，GA在此復(fù)合膜內(nèi)的氧化動力學(xué)過程為吸附控制過程。這也證明了，隨掃描次數(shù)的不斷增加，峰電流逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象。

圖2 不同掃描速度下GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE電極上的循環(huán)伏安圖

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 不同修飾材料對GA氧化峰電流的影響

王曉崗等［11－12］利用L－天冬氨酸修飾電極來檢測茶多酚、阿魏酸等和許紅巖等［13］利用Nafion／單壁碳納米管／聚（3－甲基噻吩）修飾電極來檢測綠茶飲料中的GA。本研究利用L－天冬氨酸在電極表面形成含有大量羧基且穩(wěn)定的聚合物膜，并修飾比表面積大和吸附能力較強的MWCNTs，制備了響應(yīng)靈敏的poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極，如圖3所示。由圖3中可以看出GA在poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極的氧化峰電流明顯大于其他2個修飾電極，這證明MWCNTs可以加強電聚合物與電極表面的電子傳遞從而提高修飾電極的電流響應(yīng)的靈敏度。

圖3 4.2×10－4 mol／L GA在不同修飾電極的循環(huán)伏安圖

2.3.2 電解質(zhì)溶液的選擇和溶液pH值的影響

GA在堿性條件下易被氧化，會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，所以本試驗選擇的支持電解質(zhì)溶液為酸性范圍中的緩沖溶液。如圖4，在不同的電解質(zhì)溶液中，研究了它們對1.5×10－4mol／L的GA的電化學(xué)行為的影響。

圖4 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE電極在不同電解質(zhì)溶液中的循環(huán)伏安圖

結(jié)果表明，GA在不同緩沖液介質(zhì)中，其電化學(xué)行為類似，僅是峰位置和峰電流不同而已。在0.2 mol／L磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液中GA峰電流最大且峰形良好。故選擇0.2 mol／L磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液作為電解質(zhì)溶液。

圖5為8.0×10－5mol／L的GA在不同pH磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液的微分脈沖圖。峰電流在pH 3.0時達(dá)到最高值，當(dāng)pH 7.0后，氧化峰消失。GA的氧化峰電位隨溶液pH值的增大而不斷負(fù)移，表明GA的電化學(xué)過程伴隨著質(zhì)子的參與。GA的氧化峰電位（Epa）與支持電解質(zhì)pH在2.0～5.0之間呈良好線性關(guān)系（如圖6），其線性回歸方程為：Epa＝0.664 5－0.08pH（Epa單位為 V），R2＝0.991 9，由于斜率 d（Epa）／d（pH）＝0.08可知，GA在電化學(xué)過程中的電子轉(zhuǎn)移數(shù)與質(zhì)子數(shù)相同。綜上所述，試驗中選擇pH 3.0，0.2 mol／L磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液作為電解質(zhì)溶液。

圖5 GA在不同pH值條件下的微分伏安圖

圖6 pH值與峰電流和峰電位的關(guān)系

2.3.3 聚合物膜厚度和MWCNTs用量對GA氧化峰電流的影響

研究了1.5×10－4mol／L的GA的氧化峰電流與L－天冬氨酸修飾圈數(shù)的關(guān)系，如圖7所示，隨著修飾圈數(shù)增加，修飾電極在GA溶液中的峰電流增大，但當(dāng)循環(huán)掃描到達(dá)15圈時，氧化峰電流達(dá)到最大值，當(dāng)超過15圈后，峰電流有所下降。這可能是因為聚合膜太厚，阻止電子的傳遞。故選擇L－天冬氨酸修飾圈數(shù)為15圈。

圖7 L－天冬氨酸修飾圈數(shù)對峰電流的影響

如圖8所示，在選擇最優(yōu)修飾圈數(shù)后，對MWCNTs最佳用量進(jìn)行了研究所示，氧化峰電流開始隨MWCNTs用量的增加而顯著增加，這是因為電極表面富集活性位增多，對GA表現(xiàn)出高的富集效率，導(dǎo)致氧化峰電流增加。當(dāng)超過5μL后，氧化峰電流逐漸降低，這是因為此時電極表面的MWCNTs量太多，阻礙了電子交換。故本試驗中MWCNTs的用量為5μL。

圖8 MWCNTs的用量對2.4×10－4 mol／LGA峰電流的影響

2.3.4 電參數(shù)的選擇

微分脈沖伏安法能有效降低背景電流，具有簡單快速、靈敏度高、選擇性強和分辨率高等優(yōu)點，因此選擇此方法對GA進(jìn)行檢測分析。試驗表明，設(shè)定的電參數(shù)為初始電位0.0 V，終止電位1.0 V，電位增量0.001 V，脈沖幅度0.05 V，脈沖寬度0.05 s，脈沖間隔0.3 s，等待時間5 s，此時GA有較好的峰型且峰電流大。

2.4 修飾電極的抗干擾能力

在pH 3.0磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液中，固定GA的濃度為2×10－5mol／L。考察了一些常見的離子和有機化合物對GA測定的干擾。試驗表明50倍的NO3－對測定結(jié)果沒有影響；5倍的葡萄糖、山梨酸、苯甲酸、苯酚、抗壞血酸、VE，對響應(yīng)信號沒有影響，氧化峰電位基本不變，顯示出良好的抗干擾能力。因此該修飾電極可以用于實際樣品中束縛型酚酸的測定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

圖9給出GA在修飾電極上的微分脈沖伏安響應(yīng)曲線，由圖9可知，峰電流（Ipa）隨GA濃度的增加而增加，并在2×10－6～5.6×10－5mol／L范圍內(nèi)，GA濃度與Ipa呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性方程為Ipa＝0.136 4＋0.015C（Ipa單位為 μA，C單位為 μmol／L），相關(guān)系數(shù)為R2＝0.993 4，最低檢出限為7.6×10－7mol／L（信噪比為 S／N＝3），其靈敏度為0.015μA／（μmol／L）。

圖9 不同濃度的GA在修飾電極上的微分脈沖伏安圖和標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線

2.6 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

按1.3.2方法及優(yōu)化條件制備10支poly－LAsp／MWCNTs／GCE修飾電極，采用微分脈沖伏安法對2.4×10－5mol／L的GA進(jìn)行重復(fù)性試驗測定研究，測定結(jié)果的GA的氧化峰電流的平均值為3.02 μA，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%，表明該法制備的修飾電極具有良好的重現(xiàn)性。

同樣方法制備 1支 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極，對2.4×10－5mol／L的GA進(jìn)行6次測定，平均響應(yīng)電流（3.18±0.02）μA，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.03%。同樣方法制備修飾電極置于4℃的冰箱保存，1周后其電流響應(yīng)為初始電流響應(yīng)值的93%，4周后電極響應(yīng)為到初始值的85%。由此表明本研究制備 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極具有良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。

2.7 小麥麩皮中酚酸的測定

利用 poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極測定了小麥麩皮中酚酸的含量，為了驗證該方法的有效性，同時利用Folin－Ciocalteu比色法測定同一樣品中的酚酸，并加以對比，測定結(jié)果如表1所示，試驗結(jié)果表明本研究開發(fā)的poly－L－Asp／MWCNTs／GCE修飾電極法的測定結(jié)果與Folin－Ciocalteu比色法一致。

表1 小麥麩皮中束縛型酚酸的測定和加標(biāo)回收率（n＝6）

3 結(jié)論

用電聚合法及吸附法耦聯(lián)技術(shù)制備了poly－LAsp／MWCNTs／GCE修飾電極，該修飾電極對 GA的氧化具有顯著的催化作用。

用循環(huán)伏安法研究了GA在該電極上的電化學(xué)行為，并對分析條件進(jìn)行了優(yōu)化，該修飾電極對GA的催化氧化電流與其濃度在2×10－6～5.6×10－5mol／L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，該方法最低檢測限為7.6×10－7mol／L。用該納米修飾電極測定小麥麩皮中束縛型酚酸，其測定結(jié)果與Folin－Ciocalteu比色法的測定結(jié)果一致，且具有簡便、快速、靈敏的優(yōu)點。

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Preparation of Poly－L－Aspartic acid／MWCNTs Modified Electrode for Fast Determination of Phenolic Acid in Wheat Bran

Wang Liran Li Shuguo

（Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018）

The poly－L－Asp／MWCNTs modified electrodes have been prepared combined with electro－polymerization and absorption method.The voltammetry behavior of gallic acid on the poly－L－Asp／MWCNTs modified electrode has been studied.A new method to determine phenolic acid in wheat bran by differential pulse voltammetry was established.In disodium hydrogen phosphate and citric acid buffer solution（pH 3.0），the modified electrode showed a strong electrocatalytic activity on the oxidation of gallic acid；the electrode reaction of gallic acid was an adsorption control process.On optimized conditions，the calibration curves of determination of gallic acid in foods showed an excellent linear response in range 2×10－6～5.6×10－5mol／L with detection limit of 7.6×10－7mol／L.The developed method was successfully applied in the determination of total phenolic acid in wheat bran；the results of（1 130.8±4.50）μg／g were well consistent with the national standard method as Folin－Ciocalteu colorimetric method（1 180.7±8.18）μg／g.It is feasible to use poly－L－Asp／MWCNTs modified electrodes for fast determination of phenolic acid in food with less requirement of chemical reagent.

phenolic acid，Nano Modified Electrode，wheat bran，fast determination

TS207.3

A

1003－0174（2015）04－0130－06

國家自然科學(xué)基金 （20876165），河北省教育廳科技項目（2009329）

2013－12－31

王麗然，女，1988年出生，碩士，食品科學(xué)與安全

李書國，男，1969年出生，教授，糧油食品科學(xué)與安全技術(shù)