褚 璇 王 偉 Lawrence Kurt C Ni Xinzhi Heitschmidt Gerald W 張楠楠 彭彥昆

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院1，北京 100083）（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所質(zhì)量與安全評估研究中心2，雅典 30605，美國）（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所作物遺傳和育種研究中心3，提夫頓 31793，美國）（山東理工大學(xué)電氣與電子工程學(xué)院4，淄博 255049）

基于顏色特征的含黃曲霉毒素玉米顆粒的檢出方法

褚 璇1王 偉1Lawrence Kurt C2Ni Xinzhi3Heitschmidt Gerald W2張楠楠4彭彥昆1

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院1，北京 100083）（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所質(zhì)量與安全評估研究中心2，雅典 30605，美國）（美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究所作物遺傳和育種研究中心3，提夫頓 31793，美國）（山東理工大學(xué)電氣與電子工程學(xué)院4，淄博 255049）

為快速準(zhǔn)確識別出感染黃曲霉毒素的玉米顆粒，基于黃曲霉毒素在365 nm紫外光照射下可發(fā)出黃綠色熒光（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF）的特性，提出了一種以顏色為特征量的感染毒素顆粒的檢出方法。首先針對同一組玉米顆粒樣本分別獲取其在紫外光和可見光下的2幅圖像，對可見光圖像進(jìn)行二值化、顆粒區(qū)域填充等預(yù)處理操作，得到玉米顆粒的輪廓與位置信息；然后將進(jìn)行彩色增強(qiáng)后的紫外光圖像與預(yù)處理后的可見光圖像掩膜；最后在掩膜圖像中通過RGB模型中G通道下的閾值作為分割參數(shù)識別玉米顆粒上的感染區(qū)域。結(jié)果表明，所提出的識別方法對能夠發(fā)出熒光的含黃曲霉菌玉米顆粒識別準(zhǔn)確率達(dá)到84%以上，對含有黃曲霉毒素的正確檢出率可達(dá)77.8%以上，能夠達(dá)到區(qū)分檢測的要求。

玉米 黃曲霉毒素 彩色熒光圖像 黃綠色熒光 無損檢測

玉米是我國主要的經(jīng)濟(jì)型糧食作物，但在高溫干旱環(huán)境下極易受到黃曲霉毒素的污染［1－2］。據(jù)FAO統(tǒng)計，全球每年25%的糧食產(chǎn)品因真菌毒素污染而不能食用［3］。黃曲霉毒素屬于真菌毒素，是某些黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的毒性代謝產(chǎn)物，能夠致癌、致畸、致突變［4－5］，其毒性也可通過食物鏈累積，更加大了危害人體健康的可能性。據(jù)調(diào)查，近年來肝癌的發(fā)病人群持續(xù)增加與食用因霉變而感染黃曲霉毒素的糧食密切相關(guān)［6］。因此，檢測出受到黃曲霉毒素污染的玉米，對保證人民生命財產(chǎn)安全和我國糧食來源的可持續(xù)性安全都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

黃曲霉毒素的傳統(tǒng)檢測方法有氣相色譜法（GC）［7］、高效液相色譜法（HPLC）［8］、薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫（ELISA）［9］等，這些方法操作復(fù)雜、采樣準(zhǔn)備時間長、費(fèi)用高，不適合在線批量檢測［10］。另外，雖也有通過電子鼻或人工嗅覺實(shí)現(xiàn)糧食霉變的快速檢測［11－12］，但這些方法的檢測對象是封存在倉儲室中的糧食，無法滿足在線檢測的需要。

相比之下，機(jī)器視覺技術(shù)能夠靜態(tài)或?qū)崟r獲得圖像信息，并通過相應(yīng)算法獲取檢測目標(biāo)，具有快速、準(zhǔn)確和無損等優(yōu)點(diǎn)，正越來越多地代替人工完成工作［13］，機(jī)器視覺技術(shù)在農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展迅速［14－17］。Pearson等［18］利用機(jī)器視覺技術(shù)區(qū)分開心果中的污漬果仁、干癟果仁和霉變果仁。在霉變糧食檢測方面，Liu等［19］通過機(jī)器視覺系統(tǒng)計算精大米表面的類脂物，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)大米分級。陳紅等［20］以顏色和紋理特征作為輸入，較好地識別出霉變的花生。

國外研究結(jié)果表明［21－23］，當(dāng)玉米顆粒感染黃曲霉菌時，在365 nm紫外光下會激發(fā)出黃綠色熒光（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF），這是含有過氧化酶的活細(xì)胞的一種特性。由于黃曲霉菌在玉米顆粒中生長時會產(chǎn)生曲酸并將其轉(zhuǎn)化成過氧物酶形式的BGYF化合物，同時，在這個過程中也會產(chǎn)生黃曲霉毒素。鑒于黃曲霉毒素與產(chǎn)生黃綠色熒光的化合物有大部分重疊，可以通過獲取待檢玉米顆粒在紫外光下的圖像，以圖像中顆粒上是否含有熒光部分作為依據(jù)，判斷其是否含有黃曲霉毒素。

但紫外光下的所獲得的圖像，對玉米顆粒輪廓和樣品背景等特征信息辨識度有限，而利用可見光下的圖像則可以很容易的對輪廓信息進(jìn)行準(zhǔn)確識別。因此本試驗(yàn)同時獲取玉米顆粒在365 nm紫外光和可見光下的2幅圖像，同步獲得熒光信息和完整玉米顆粒輪廓等圖像信息，基于VS2010軟件平臺編程，通過2張圖像配合，實(shí)現(xiàn)對感染黃曲霉毒素玉米顆粒的識別。

1 材料與方法

1.1 樣品準(zhǔn)備

選用2012年8月在美國喬治亞州，提夫頓市（Tifton，Georgia，USA）收獲的玉米顆粒為樣本進(jìn)行圖像采集。為保證樣本在收獲時已感染黃曲霉菌，在這些玉米生長早期，便通過鋼針向玉米穗注入了3 mL濃度為4×106孢子／mL的黃曲霉菌分生孢子懸浮液。收獲后，首先用空氣干燥機(jī)對玉米棒進(jìn)行干燥，然后在通風(fēng)櫥內(nèi)剝?nèi)ネ馄ぃ⒂?65 nm波長的紫外光照射，用鑷子提取表現(xiàn)出熒光的顆粒及其周圍的顆粒，另外提取距離發(fā)熒光顆粒較遠(yuǎn)的不發(fā)熒光的顆粒作為對照。將提取出的玉米顆粒按順序擺放在用白色Teflon制作的背景板上，每個背景板上有30個容孔，其中因感染嚴(yán)重而破損的顆粒放置在最右側(cè)的3列，正常玉米顆粒則放置在最左側(cè)的兩列，并保證每粒的玉米的胚芽和尖端朝向一致。

1.2 圖像獲取與化學(xué)檢測

為保證足夠的清晰度，試驗(yàn)采用分辨率為4 256×2 832的相機(jī)。首先在LED光源下獲得玉米顆粒的可見光圖像（圖1a）所示，然后在保證相機(jī)與樣品相對位置不變，僅有光源更換的前提下，獲取365 nm紫外光下的圖像（圖1b）。

圖1 在LED和紫外光下相機(jī)獲得的圖像

1.3 樣品化學(xué)檢測

樣品進(jìn)行圖像采集后，用液相色譜法逐粒檢測其黃曲霉毒素的含量。首先，將每個顆粒單獨(dú)粉碎并稱重，從中取0.1～0.105 g進(jìn)行檢測，如果1個顆粒的粉末重量沒有達(dá)到0.1 g，則用整個玉米的粉末；然后，將樣品通過4∶1甲醇水溶液進(jìn)行萃取，在0.1 g粉末中加入2 mL溶液，并在振蕩器上振蕩30 min，最后，取1 mL提取液用蒸餾水稀釋4倍后將其緩慢通過AflaTest免疫親和柱，在用蒸餾水清洗2次后用甲醇洗脫，并保存洗脫液進(jìn)行高效液相色譜檢測。

1.4 試驗(yàn)總體思路

使用高分辨率相機(jī)分別獲得玉米顆粒在紫外光下和可見光下的圖像，首先為克服紫外光下圖像玉米顆粒輪廓辨識度不高的缺點(diǎn)，在可見光下圖像找到玉米顆粒位置和輪廓等信息；然后對紫外光下圖像進(jìn)行圖像增強(qiáng)處理，將增強(qiáng)處理后的紫外光下圖像與預(yù)處理后的可見光下圖像進(jìn)行掩膜操作，以此將黃曲霉毒素的熒光信息與玉米顆粒位置及輪廓信息進(jìn)行結(jié)合。最后，在掩膜后的圖像中，利用RGB顏色模型的閾值分割算法［24］找到能發(fā)出黃綠色熒光的含黃曲霉毒素的顆粒。

2 玉米圖像預(yù)處理

2.1 目標(biāo)提取

在紫外光源下采集的圖像中，玉米顆粒與背景板均呈現(xiàn)藍(lán)色，不容易標(biāo)記出單粒玉米顆粒的位置和輪廓，因此首先對可見光下的圖像進(jìn)行處理，用于準(zhǔn)確辨識玉米各顆粒輪廓及其在背景板中的位置。

在可見光源下獲得的圖像中不僅包含玉米顆粒信息，還包括背景板、試驗(yàn)臺、標(biāo)簽等信息，若對全部圖像進(jìn)行處理，會有數(shù)據(jù)量大、處理時間長等問題，另外試驗(yàn)臺、標(biāo)簽紙等也會對單粒玉米顆粒的位置提取造成干擾，因此在處理之前提取玉米顆粒排列的區(qū)域作為感興趣區(qū)域，如圖2所示。

圖2 從原圖中提取感興趣區(qū)域

為進(jìn)一步減輕運(yùn)算量將彩色圖像轉(zhuǎn)化為灰度圖像，根據(jù)人眼對3種顏色的敏感度不同，通過加權(quán)平均法實(shí)現(xiàn)圖像灰度化［25］。轉(zhuǎn)換結(jié)果如圖3所示。

圖3 灰度圖像

為了將目標(biāo)圖像與背景分隔開［26］，在灰度圖像中，根據(jù)玉米顆粒與背景之間在灰度值上存在的差異，使用閾值分割方法進(jìn)行背景分割［27］。在閾值分割法中，認(rèn)為圖像中處于同一灰度范圍內(nèi)的像素點(diǎn)來自同一個物體［28］。從圖4a所示的直方圖中可看出背景和玉米顆粒各自形成1個波峰，因此選擇處于兩峰中間位置的波谷所對應(yīng)的灰度值作為分離2個區(qū)域的閾值。進(jìn)一步的，利用這個閾值將圖像分成2部分G1和G2，并計算這2個區(qū)域的平均灰度值g1、g2，以此得到新閾值T＝（g1＋g2）／2，循環(huán)計算直到g1、g2的值不在發(fā)生變化［29］。結(jié)合直方圖和計算結(jié)果，選取195為分割閾值，像素值小于195時認(rèn)為是玉米顆粒，否則認(rèn)為是背景。處理后結(jié)果如圖4b。

圖4 直方圖和二值化圖像

2.2 膨脹腐蝕去噪聲

二值化后的圖像存在一些椒鹽噪聲，試驗(yàn)中選擇膨脹與腐蝕的方法予以消除。膨脹的作用是將與物體接觸的所有背景點(diǎn)合并到物體中，使目標(biāo)增大［27］，腐蝕是相對于膨脹的操作。在2次膨脹腐蝕處理后，二值圖像中存在的椒鹽噪聲大部分已被去除了，但在玉米顆粒表面因反光而形成的孔洞也被放大了，因此需對這些空缺的區(qū)域進(jìn)行填充。由于圖像中在多個玉米顆粒上存在不同的孔洞，選擇遍歷查找玉米最外層輪廓并填充其內(nèi)部的方法進(jìn)行處理。填充后如圖5所示，初步確定了每個玉米顆粒的位置。

圖5 去噪聲與填充后圖像

3 圖像處理

3.1 掩膜

為了在紫外光下獲取的圖像中找到玉米顆粒的位置，將其與預(yù)處理后的可見光圖像進(jìn)行掩膜計算［30］。遍歷查找二值圖像中每個像素點(diǎn)的灰度值，若此值為0，則將紫外光下圖像對應(yīng)的像素點(diǎn)信息復(fù)制到二值圖像中，如圖6顯示，在掩膜后的圖像中只在玉米顆粒區(qū)域處顯示紫外光圖像信息。

圖6 掩膜后圖像

3.2 黃曲霉菌毒素感染區(qū)域提取

本試驗(yàn)在RGB模型下，通過閾值分割法對玉米顆粒上感染黃曲霉毒素的部分進(jìn)行提?。?1］。從采集到的圖片中看出黃曲霉毒素在365 nm紫外光下發(fā)出明顯的黃綠色熒光，建立R［256］、G［256］、B［256］3個數(shù)組存儲各個通道下的圖像信息，在紫外光下黃綠色熒光區(qū)域的像素值范圍分別為R：150～210，G：200～238，B：185～235。3個通道下直方圖分別如圖7所示。

圖7 在3個通道下的直方圖

從彩色直方圖可以看出在G通道下有2個相對明顯的波峰，且其熒光部分與背景的區(qū)分優(yōu)于R和B通道，而且只采用G通道下閾值進(jìn)行檢測，不僅能夠達(dá)到檢測的目的，也能簡化運(yùn)算。但從這種方法只檢測到了黃綠熒光信息相對明顯的感染部分，檢測準(zhǔn)確率不高，如圖8所示。因此為提高檢測準(zhǔn)確率，需要進(jìn)一步對紫外光下圖像進(jìn)行優(yōu)化或增強(qiáng)。

圖8 檢測結(jié)果

3.3 優(yōu)化熒光圖片

在熒光圖像中進(jìn)行圖像增強(qiáng)操作可以擴(kuò)大圖像中不同物體特征之間的差別。參考MATLAB中的函數(shù)imadjust.m中式（2）進(jìn)行圖像增強(qiáng)。

式中：I為輸入圖像，J為輸出圖像，gamma為描述值I和J關(guān)系的曲線形狀，將在low和high之間的值映射到bottom和top之間。在紫外圖像中，對3個通道分別按照式（3）［32］進(jìn)行調(diào)整

式中：B為一個通道中原像素值；B′為增強(qiáng)后像素值?？梢钥闯鰣D像增強(qiáng)后熒光部分更加明顯（圖9）。運(yùn)行后檢測的準(zhǔn)確性顯著提高，另外，為便于統(tǒng)計帶熒光的玉米顆粒數(shù)。將含毒素的熒光區(qū)域的檢測結(jié)果圖像與玉米輪廓圖像合并，從而顯示出含有黃曲霉毒素的玉米顆粒，圖像增強(qiáng)后檢測結(jié)果如圖10所示。

圖9 彩色增強(qiáng)圖像

圖10 彩色增強(qiáng)后檢測結(jié)果

4 結(jié)果與討論

在圖像檢測結(jié)果中，將在玉米顆粒輪廓內(nèi)含有黑像素的顆粒判定為含毒素顆粒，在HPLC檢測結(jié)果中，將毒素含量超過20 mg／kg標(biāo)準(zhǔn)的顆粒判定為含毒素顆粒，將紫外光下熒光顯示情況與HPLC的檢測結(jié)果通過混淆矩陣表示。如表1所示，含有毒素的顆?；径及l(fā)出熒光，其相關(guān)性達(dá)到0.82，基本可以將是否有熒光顯示作為判定是否含有毒素的標(biāo)準(zhǔn)。另外為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，將圖像處理結(jié)果、紫外光下熒光顯示結(jié)果、HPLC檢測結(jié)果通過混淆矩陣表示，如表2所示。

表1 熒光顯示與HPLC檢測結(jié)果

表2 圖像檢測結(jié)果

從表2中可以看出，利用本試驗(yàn)提出的圖像處理方法基本可以有效地識別出含有熒光反應(yīng)的顆粒，其準(zhǔn)確率為96.3%；但由于存在含有毒素卻不顯示熒光的假陰性現(xiàn)象，與不含毒素卻顯示熒光的假陽性現(xiàn)象，所以利用HPLC與圖像檢測結(jié)果進(jìn)行對照，所提圖像檢測方法對含毒素顆粒的識別正確率為77.8%。

為進(jìn)一步驗(yàn)證本試驗(yàn)方法的適用性，按照1.1方法提取出25粒玉米種子組成驗(yàn)證組，如圖11a所示，與訓(xùn)練組相同方法進(jìn)行圖像獲取及處理，其檢測結(jié)果如圖11b所示。驗(yàn)證組的檢測結(jié)果分別在表1、表2中列出。

從表2結(jié)果可以看出，在驗(yàn)證組中利用本試驗(yàn)提出的圖像處理方法對于含熒光顆粒的識別準(zhǔn)確率能夠達(dá)到84%，對含毒素顆粒的檢測準(zhǔn)確率為84%。

在圖像中，部分玉米顆粒感染黃曲霉菌已經(jīng)存在發(fā)黃發(fā)黑的現(xiàn)象，在紫外光下其色彩與發(fā)熒光部分的顏色非常接近，因此會出現(xiàn)將此類玉米粒判斷為發(fā)熒光顆粒的現(xiàn)象，但總體來說這種方法對發(fā)熒光顆粒的識別準(zhǔn)確率較高。

另外，由于有一部分顆粒呈現(xiàn)假陰性，這導(dǎo)致了這種圖像檢測方法對含毒素顆粒的漏檢；同時也存在一些呈現(xiàn)假陽顆粒性，其僅含有黃曲霉菌的BYGF代謝產(chǎn)物，在紫外光下也會激發(fā)出熒光，這導(dǎo)致了圖像檢測的誤判，但假陽性顆粒已含有黃曲霉菌，這類顆粒的誤判在實(shí)際檢測中是允許的。

圖11 玉米顆粒熒光圖像及其檢測結(jié)果

這種方法作為含有黃曲霉顆粒的檢測方法已有較好的檢出效果，并且，本研究提出的通過機(jī)器視覺檢測的方法與傳統(tǒng)化學(xué)檢測方法相比，減少了試樣準(zhǔn)備時間，不僅節(jié)省了費(fèi)用，而且能夠達(dá)到快速準(zhǔn)確的要求，能夠作為含毒素糧食在線檢測的儲備技術(shù)，在工業(yè)應(yīng)用中具有廣泛的前景，但是距離直接用作在線、快速動態(tài)分選檢測設(shè)備的實(shí)用檢測技術(shù)還有一些差距，因此進(jìn)一步的工作重點(diǎn)主要包括：1）研究黃曲霉毒素?zé)晒馓卣?，分析其與BYGF代謝產(chǎn)物所發(fā)出熒光的區(qū)別減少假陽性顆粒的干擾；同時尋找未發(fā)出熒光的含毒素顆粒特征，尋找假陰性顆粒的檢測方法；2）在確保檢測準(zhǔn)確度的同時進(jìn)一步精簡圖像處理算法，研究相應(yīng)的動態(tài)檢測算法，為研制實(shí)用的霉變或毒素顆粒檢出裝備奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究主要對玉米顆粒靜態(tài)高分辨圖像進(jìn)行分析處理，驗(yàn)證了機(jī)器視覺技術(shù)檢測感染黃曲霉毒素的玉米的可行性。

基于采集的玉米顆粒在紫外光與可見光下的圖像，在2種光源下2幅圖像配合處理后，通過RGB模型下的閾值分割法，能夠?qū)崿F(xiàn)感染黃曲霉毒素玉米顆粒的檢出。不僅可以清楚找到玉米顆粒位置，也可以找到單粒玉米顆粒上能夠發(fā)出熒光的區(qū)域，優(yōu)于單一光源下的圖像的檢測效果。

對紫外光下圖像進(jìn)行圖像增強(qiáng)后，能夠提高發(fā)熒光顆粒檢出的準(zhǔn)確率，在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中熒光顆粒的識別準(zhǔn)確率分別為96.3%、84%；由于圖像處理假陰性顆粒檢測的不足，這種方法對訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中含黃曲霉毒素顆粒的檢測準(zhǔn)確率分別為77.8%、84%。

試驗(yàn)結(jié)果表明本研究所提出的檢出方法作為含黃曲霉毒素顆粒的假設(shè)檢驗(yàn)方法是可行的，同時也可以作為霉變糧食在線分選檢測和裝備研制的儲備技術(shù)。

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Detection Method of Corn Kernels Infected Aflatoxin Based on Color Features

Chu Xuan1Wang Wei1Lawrence Kurt C2Ni Xinzhi3Heitschmidt Gerald W2Zhang Nannan4PengYankun1

（College of Engineering，China Agriculture University1，Beijing 100083）（Quality＆Safety Assessment Research Unit2，USDA－ARS，Athens 30605，USA）（Crop Genetics and Breeding Research Unit3，USDA－ARS，Tifton 31793，USA）（College of Electrical and Electronic Engineering，Shandong University of Technology4，Zibo 255049）

Based on the special feature that corn kernels infected aflatoxin will emit visible fluorescence（bright greenish－yellow fluorescence，BGYF）when irradiated by 365 nm UVL，the new method for quickly and accuratelyscreening corn kernels infected with aflatoxin has been proposed in the paper.First，two images of the identical set of corn kernels were taken under the UVL and the LED light respectively.On the image acquired under LED light，image binaryzation and particle domain filling were used to determine the contour and positional information of each corn kernel.Second，the image obtained under UVL was enhanced and combined with the binary image under LED light by the mask method.Finally，the threshold value ofGchannel was used to screen the area of single kernel infected aflatoxin.The results showed that the accuracy of BYGF kernels and the kernels contained aflatoxin identification could be over 95%and 77.8%respectively，which indicated the usefulness of the proposed method.

corn kernel，aflatoxin，color fluorescence images，bright greenish－yellow fluorescence，non－destructive detection

S513 TP391.4

A

1003－0174（2015）04－0112－07

國家科技支撐計劃（2012BAK08B04）

2013－12－31

褚璇，女，1990年出生，碩士，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)安全檢測技術(shù)及裝置研究

王偉，男，1975年出生，副教授，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)安全檢測技術(shù)及裝置研究