李新滿 胡義平

河南南陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473000

本實驗通過建立實驗性糖尿病腦病動物模型，觀察視海馬神經(jīng)元AKt及PI3K mRNA 表達(dá)的變化，探討其在糖尿病腦病病理變化中的作用機(jī)制，證實rhIGF-1 對糖尿病腦?。―E）保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床治療DE提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 實驗動物分組及模型建立 由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供的成年3月齡健康Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量180～250 g，共45只。將實驗動物隨機(jī)分為3組：正常組、模型組、治療組，參考Li等［1］方法建立DE 模型。實驗期間自由飲食、水，注意通風(fēng)、干燥和清潔，保持安靜。3月后通過經(jīng)鼻腔入腦給藥rhIGF-1（溶于0．5mL 生理鹽水）1周，2次／d。實驗過程中棄去不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的大鼠。

1．2 MAZE-I Y 型電迷宮試驗 參照王躍春等［2］報道的測定學(xué)習(xí)記憶的方法進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測試，統(tǒng)計大鼠學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)頻率，以百分比表示。

1．3 取材及切片制作 電迷宮實驗后，麻醉動物，斷頭置于冰臺上，取出海馬，4%的多聚甲醛中固定，石蠟包埋。其余動物直接取腦組織海馬區(qū)，置于—80 ℃液氮中保存。

1．4 腦組織HE 染色 常規(guī)石蠟切片脫蠟至水化，蘇木精溶液染色，酸水及氨水分色，梯度酒精中脫色，再用酒精伊紅染色，然后脫水、透明，最后中性樹膠封固，光鏡下觀察CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量變化。

1．5 免疫組化法檢測大鼠海馬PI3K 和AKt的表達(dá) 室溫孵育10min在3% H2O2中，用檸檬酸緩沖液熱修復(fù)抗原15 min，37 ℃下用山羊血清封閉10min，繼之用兔抗大鼠PI3K（1∶200）和AKt抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜。充分洗滌后用生物素標(biāo)志的二抗37 ℃孵育，滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，最后DAB 顯色。染色設(shè)PBS（代替一抗）作陰性對照。最后Imagine pro plus軟件測定其灰度值。

1．6 RT-PCR檢測PI3K 和AKt mRNA 的表達(dá) 大鼠海馬RNA 常規(guī)方法提取，測定其總RNA 濃度及計算純度。采用RT-PCR檢測PI3K mRNA、AKt mRNA 的表達(dá)。PI3-K：上游5’GAGTCCTATTGTCGTGACTGTTGG 3’，下 游：5’AAGCCTGAGGTTTCCTAGTTGAT 3’，預(yù)擴(kuò)增長度233bp；AK：上游5’TGCTGGAGGACAATGACTAC 3’，下游5’CACGATACCGGCAAAGAA 3’，預(yù)擴(kuò)增長度277bp；GAPDH：上 游：5’GAGCCAAAAGGGTCATCATCTC 3’，下游引物序列5’AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTC 3’，預(yù)擴(kuò)增長度542bp。使用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物電泳后對目的條帶進(jìn)行密度分析。

1．7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17．0軟件包，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗及單因素方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 rhIGF-1對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 模型組大鼠（每組6只）學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)率（4次，20%）明顯高于對照組（1次，5%），但經(jīng)治療后，治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶錯誤反應(yīng)率（2次，10%）明顯低于模型組（P＜0．05）。

2．2 rhIGF-1對大鼠海馬病理改變的影響 HE 染色顯示，正常組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列整齊，胞體圓形，核染色質(zhì)著色均勻。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，數(shù)量減少，變性細(xì)胞呈不規(guī)則形狀，部分神經(jīng)元胞核或胞漿缺失，呈空泡狀。與模型組組比較，治療組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，變性細(xì)胞減少。見圖1。

2．3 免疫組化檢測rhIGF-1對大鼠海馬PI3K 和AKt蛋白表達(dá)的影響 PI3K 和AKt蛋白治療組表達(dá)呈強(qiáng)陽性，胞質(zhì)或包膜出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽性表達(dá)率為82．3%和80．6%（P＜0．01），而模型組陽性表達(dá)率明顯下降為41．7% 和40．1%，差異統(tǒng)計學(xué)亦有意義（P＜0．01）；但治療組和對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．456＞0．05）。見圖2。

2．4 PT-PCR結(jié)果 海馬區(qū)PI3K 和AKt mRNA 的表達(dá)變化：模型組大鼠海馬區(qū)PI3K、AKt mRNA 表達(dá)明顯低于正常組（P＜0．01），治療后大鼠海馬區(qū)PI3K 及AKt mRNA 的表達(dá)高于模型組組（P＝0．028），治療組和正常組比較差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0．763）。見圖3、圖4。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)HE染色（×400）

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測AKt及PI3K 的表達(dá)（S-P，×400）

圖3 RT-PCR檢測AKt及PI3K 基因轉(zhuǎn)錄水平

圖4 各組大鼠海馬AKt及PI3K mRNA 的相對表達(dá)量

3 討論

糖尿病腦病患者以輕、中度認(rèn)知功能障礙為主要表現(xiàn)，認(rèn)知功能損害主要在聯(lián)想記憶、學(xué)習(xí)技能及注意力方面。其發(fā)病機(jī)制可能與腦老化過程中神經(jīng)因子缺失相關(guān)，胰島素樣生長因子Ⅰ／Ⅱ、NGF、胰島素的表達(dá)下降［3］。IGFⅠ／Ⅱ與其受體結(jié)合后主要通過PI3K 通路激活神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持神經(jīng)元存活；反之，在凋亡等損傷刺激因素的作用下，神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏可使神經(jīng)元功能受損而發(fā)生凋亡［4］。PI3K／Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與許多生物學(xué)功能，包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞生存、細(xì)胞凋亡等，在認(rèn)知功能障礙的研究中發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元由于Akt表達(dá)的減少，導(dǎo)致神經(jīng)元處于凋亡或凋亡前期狀態(tài)［5］。本實驗結(jié)果顯示，我們觀察到模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡明顯，大鼠的認(rèn)知功能嚴(yán)重受損，大鼠海馬CA1區(qū)AKt及PI3K 的表達(dá)較正常對照組明顯減少，與相關(guān)報道結(jié)果吻合。因此，PI3K／AKt信號通路對糖尿病腦病患者有重要的意義，通過調(diào)控PI3K／Akt信號通路的活性可以影響細(xì)胞的凋亡，最終達(dá)到改善老齡化記憶功能減退的目的［4-5］。

rhIGF-1是一種強(qiáng)烈的促合成因子，進(jìn)入血液后與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)IGF-1受體水平，激活PI3K／AKt信號通路，維持神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)的存活，保護(hù)神經(jīng)，常用于各種類型的神經(jīng)損傷疾病的治療［6］。本實驗結(jié)果顯示，我們觀察到治療組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞數(shù)量增多，海馬CA1區(qū)AKt及PI3K 的表達(dá)較模型組表達(dá)增多，大鼠的認(rèn)知功能明顯改善。因此，特異性激活PI3K-Akt信號通路是干預(yù)糖尿病腦病的潛在靶點［7］。

綜上所述，rhIGF-1 鼻腔給藥可增加大鼠海馬PI3K／Akt的表達(dá)，改善了大鼠的認(rèn)知功能。因此，PI3K／Akt信號通路可能參與抑制凋亡細(xì)胞死亡，對大腦神經(jīng)元增殖起重要作用。

［1］Li ZG，Zhang W，Grunberger G，et al．Hippocampal neuronal apoptosis in type 1diabetes［J］．Brain Res，2002，946（2）：221-231．

［2］王躍春，王子棟，孫黎明，等．動物學(xué)習(xí)記憶能力的Y-型迷宮測試法［J］．暨南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2001，22（5）：137-140．

［3］Wuarin L，Namdev R，Burns JG，et al．Brain Insulin-Like growth factor-ⅡmRNA content is reduced in Insulin-dependent and non-Insulin dependent diabetes mellitus［J］．Neurochem，1996，67（2）：742-749．

［4］李紅星，趙志煒，王蓉，等．糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元存活和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及APP17 肽的作用［J］．中華糖尿病雜志，2004，12（5）：369-372．

［5］代文博，曾亮．PI3K／Akt信號通路與阿爾茨海默病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］．現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（10）：1 549-1 501．

［6］Midyett LK，Rogol AD，Van Meter QL，et al．Recombinant insulin-like growth factor（IGF）-1treatment in short children with low IGF-I levels：first-year results from a randomized clinical trial［J］．J Clin Endocrinol Metab，2010，95（2）：611-619．

［7］遲毓婧，李晶，管又飛，等．PI3K-Akt信號傳導(dǎo)通路對糖代謝的調(diào)控作用［J］．中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)報，2010，26（10）：879-885．