洪金艷，李洪軍，2，賀稚非，2，鄧澤麗，陳康

1(西南大學食品科學學院，重慶，4007150)2(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點實驗室，重慶，400715)

葛花(Flos puerariae)是豆科植物甘葛藤、野葛的花［1］，是傳統(tǒng)的解酒醒脾中藥。葛花中含有黃酮類化合物、皂苷類化合物、揮發(fā)油類化合物、氨基酸、甾醇類化合物、生物堿等活性物質(zhì)［2］，具有解酒保肝［3］、保護胃腸道［4］、調(diào)節(jié)血糖血脂［5］、抗過敏［6］、消除活性氧和保護細胞［7］等作用。枳椇又稱拐棗、金鉤子、萬壽果等，為鼠李科(Rhamnaceae)枳椇屬(Hovenia thunb.)落葉喬木，枳椇子為枳椇的果實或種子，是傳統(tǒng)的解酒醒脾中藥［8］。國內(nèi)外學者已經(jīng)從枳椇子中分離出70多種成分，如黃酮類化合物、三萜皂苷類化合物、生物堿類化合物、多糖類化合物等［9-10］。并研究發(fā)現(xiàn)，枳椇子具有解酒保肝［11］、抗脂質(zhì)過氧化［12］、抗突變抗腫瘤［13］、調(diào)理胃腸道［14］、抑制組胺釋放、增強綜合體能［12］等作用。本研究采用植物乳桿菌發(fā)酵葛花與枳椇子的提取液，優(yōu)化發(fā)酵型解酒保肝活菌飲料的發(fā)酵工藝，為葛花與枳椇子的利用開發(fā)和發(fā)酵型解酒保肝活菌飲料的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

葛花，廣西玉林;枳椇子，湖北恩施;脫脂奶粉，內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司;植物乳桿菌，韓國圃美多公食品有限司;葡萄糖，蔗糖，NaOH，蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，K2HPO4·3H2O，檸檬酸二銨，CH3COONa，吐溫 -80，MgSO4·7H2O，MnSO4·4H2O，瓊脂，NaNO2，Al(NO3)3，蘆丁(98%)。

1.1.2 儀器設(shè)備

HH-W4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海赫田科學儀器有限公司;SS-325型高壓滅菌鍋，日本 TOMY公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司;UB-7型pH計，德國Sartorius AG公司;UV-2450型紫外可見分光光度計，日本島津公司;YP2001N型電子天平(感量2 000 g)，上海舜宇恒平科學儀器有限公司;FA2004型分析天平(感量0.000 1 g)，上海精密科學儀器有限公司;DL-1型萬用電爐，北京市中興偉業(yè)儀器有限公司;103B型高速中藥粉碎機，瑞安市永歷制藥機械有限公司;SW-CJ-1F型超凈工作臺，江蘇蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 菌種的活化、馴化及發(fā)酵劑的制備［15-17］

在無菌環(huán)境下，分別將少量植物乳桿菌PMO菌種純菌粉接種于滅菌后的10%脫脂乳粉液中，在其最適生長溫度下活化，傳代3次，使其活力達到正常。將活化好的菌種接種于不同比例的脫脂乳粉與提取液的混合液中逐步馴化，馴化過程見表1。在提取液中加入6%的葡萄糖，殺菌后加入3%馴化后的菌種，在最適溫度下培養(yǎng)制成發(fā)酵劑。接種馴化后的菌種于MRS固體培養(yǎng)基，用液體石蠟液封，4℃保藏待用。

表1 馴化培養(yǎng)基的制備Table 1 The preparation of domestication culture medium

1.2.2.2 提取液的制備

挑取優(yōu)質(zhì)的葛花和枳椇子，按葛花與枳椇子質(zhì)量比為2∶1，料液比1∶21稱取加水浸泡30 min后，在電爐上煮沸84 min，過濾得濾液，加同量的水再次提取，過濾得濾液，合并濾液待用。

1.2.2.3 混合、殺菌

在50 mL提取液中加入6%糖(蔗糖與葡萄糖為3∶2)作為碳源，混合均勻，70℃保溫30 min殺菌。

1.2.2.4 接種、發(fā)酵

按無菌操作要求，將馴化培養(yǎng)得到的發(fā)酵劑接入殺菌冷卻后的提取液中，然后于恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，16 h后取出放置在4℃低溫條件下冷藏。

1.2.3 發(fā)酵工藝條件的確定

1.2.3.1 發(fā)酵單因素試驗

葡萄糖與蔗糖比例的確定:稱取6%的糖(蔗糖與葡萄糖比例分別為 1∶3、2∶3、1∶1、3∶2、3∶1)加入 50 mL提取液中，70℃保溫30 min后，冷卻到35～40℃，在超凈工作臺上按照3%的比例將發(fā)酵劑接種于提取液中，于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。每個比例做3個平行，然后對發(fā)酵飲料的活菌數(shù)對數(shù)值、總酸含量、pH、總黃酮含量及感官進行分析，以探討葡萄糖與蔗糖的添加比例對飲料發(fā)酵工藝的影響(以下每項單因素試驗均設(shè)3個平行，并進行同類項目檢測及分析。)。

接種量的確定:稱取6%的糖(蔗糖與葡萄糖比例為3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保溫30 min后，冷卻到35～40℃，在超凈工作臺上分別按照2%、3%、4%、5%、6%的比例將發(fā)酵劑接種于提取液中，然后放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵溫度的確定:稱取6%的糖(蔗糖與葡萄糖比例為3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保溫30 min后，冷卻到35～40℃，在超凈工作臺上按照3%的比例將發(fā)酵劑接種于提取液中，然后分別放置在35、37、39、41、43 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。

發(fā)酵時間的確定:稱取6%的糖(蔗糖與葡萄糖比例為3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保溫30 min后，冷卻到35～40℃，在超凈工作臺上按照3%的比例將發(fā)酵劑接種于提取液中，然后放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 h。

糖添加量的確定:分別稱取4%、5%、6%、7%、8%、9%的糖(蔗糖與葡萄糖比例為3∶2)加入50 mL提取液中，70℃保溫30 min后，冷卻到35～40℃，在超凈工作臺上按照3%的比例將發(fā)酵劑接種于提取液中，然后放置在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。

1.2.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、糖添加量4個因素設(shè)計L9(34)正交試驗，以活菌數(shù)對數(shù)值和感官為評價指標，確定工藝條件。

表2 植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵工藝L9(34)正交試驗因素水平表Table 2 L9(34)arrangement of orthogonal test of the fermentation process of L.plantarum PMO

1.2.4 檢測方法

（2）過度地迎合市場預期以及二級市場的炒作造成的管理舞弊。這種過度地迎合市場預期以及二級市場的炒作的主要目的就是通過利用虛假的財務(wù)信息來操縱股票市場的價格，因為股價的上升和下降會直接受到公司財務(wù)情況的影響。因此有一些公司就為了讓股價達到自己預想的波動水平就會進行管理舞弊，以虛假的財務(wù)信息來對股價進行有效的操縱。例如，某物業(yè)公司為了讓股價達到自己預想的波動水平，蓄意提供一些不實的財務(wù)信息，從而導致股價暫時下跌，這種股價暫時下跌的現(xiàn)象會在很大程度上有利于操縱者低價買入來獲得更大的控制權(quán)或者待價而沽。這也是我國上市公司管理舞弊成因的主要原因［3］。

1.2.4.1 總酸的測定

總酸參考《GB/T 12456—2008》［20］中的電位滴定法;乳酸菌活菌數(shù)按《GB 4789.35—2010》［21］中的規(guī)定;總黃酮含量測定按《DB13/T385—1998》［22］中的規(guī)定;感官檢測參考《GB/T 12315—2008》［23］中的檢驗項目、要求和方法，對發(fā)酵飲料進行感官品評綜合打分。感官品評打分標準見表3。

1.2.4.2 正交試驗指標的歸一化計算［22-23］

正交試驗以活菌數(shù)對數(shù)值和感官為指標，需對正交試驗各指標數(shù)據(jù)進行歸一化處理，按式(1)計算各指標觀測值的評分值，然后按照加權(quán)平均的方法綜合指標值，權(quán)值分配均為0.5。

設(shè)各個指標的最大值yjmax對應(yīng)yjmax'=100分，最小值yjmin對應(yīng)yjmin'=0分。

表3 發(fā)酵飲料感官評分標準Table 3 Standards of sensory evaluation of fermented beverages

式中:yij是指標觀測值的評分值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準偏差表示，以P＜0.05為差異顯著性判斷標準;Origin軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的馴化

從圖1可以看出，隨著馴化培養(yǎng)基中提取液比例的增加，總酸含量和活菌數(shù)對數(shù)值逐漸下降。脫脂奶粉中含有乳酸菌生長需要的乳糖［15-17］，而提取液中含糖較少，所以乳酸菌在提取液中的產(chǎn)酸量和活菌數(shù)量均不能達到脫脂乳中的水平。當培養(yǎng)基中提取液含量達到60%時，乳酸菌在培養(yǎng)基中的總酸量和活菌數(shù)量已高于馴化前，當培養(yǎng)基中提取液含量為100%時，乳酸菌在培養(yǎng)基中的總酸量均比馴化前高出了1倍，活菌數(shù)對數(shù)值比馴化前高了1～1.5 lgCFU/mL。乳酸菌經(jīng)過馴化，在提取液中的總酸量和活菌數(shù)量都得到了改善，以適應(yīng)純提取液發(fā)酵體系。

2.2 乳酸菌發(fā)酵工藝的單因素實驗條件研究

2.2.1 蔗糖與葡萄糖比例的單因素實驗

糖作為微生物生長的碳源，純蔗糖或純葡萄糖都不利于乳酸菌的生長和發(fā)酵風味的形成。葡萄糖利于乳酸菌的生長繁殖，蔗糖利于優(yōu)質(zhì)發(fā)酵風味的形成，所以用部分葡萄糖代替蔗糖對發(fā)酵飲料的品質(zhì)更有利［17，24］。由圖2(a)可知，隨著蔗糖比例的增加，活菌數(shù)對數(shù)值呈下降趨勢，在蔗糖與葡萄糖比例為3∶2時出現(xiàn)拐點，活菌數(shù)急劇下降。隨著蔗糖比例的增加，總黃酮含量變化不明顯，蔗糖與葡萄糖的比例對總黃酮含量無影響。

圖1 植物乳桿菌PMO菌種馴化培養(yǎng)基中的總酸(a)和活菌數(shù)對數(shù)值(b)Fig.1 Total acid medium(a)and the viable count of the value(b)of domesticated species of L.plantarum PMO

由圖2(b)可知，隨著蔗糖比例的增加，總酸呈逐漸下降的趨勢，pH呈逐漸上升的趨勢。

由圖2(c)可知，隨著蔗糖比例的增加，感官評分呈先升高后下降的趨勢，在蔗糖與葡萄糖比例為3∶2時，感官最好。因此選擇蔗糖與葡萄糖比例為3∶2。

2.2.2 乳酸菌接種量的單因素實驗

不同接種量的乳酸菌會使發(fā)酵后的飲料中活菌數(shù)、總酸、pH和感官差異很大，影響了飲料的品質(zhì)［15，17，24］。由圖 3(a)可知，隨著菌種接種量的增加，發(fā)酵后活菌數(shù)對數(shù)值呈先增加后減少的趨勢，接種量從2%到4%，活菌數(shù)對數(shù)值增加明顯，接種量從4%到6%，活菌數(shù)對數(shù)值下降趨勢緩慢;隨著接種量的增加，總黃酮含量變化不明顯，可見菌種接種量對飲料的總黃酮的含量無影響。

由圖3(b)可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵后總酸含量呈逐漸增加的趨勢，接種量從2%到3%，總酸含量增加明顯，而接種量從3%到6%，總酸含量增加較少，含量無明顯差異;pH呈逐漸下降的趨勢，接種量從2%到3%下降明顯，從3%到6%下降趨勢平緩。

由圖由圖3(c)可知，隨著菌種接種量的增加，發(fā)酵飲料感官評分呈先上升后下降的趨勢，在接種量為3%時感官評分最高。本實驗選擇接種量為3%。

圖2 蔗糖與葡萄糖比例對植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的影響Fig.2 Effect of the ratio of sucrose and glucose for the fermented beverages of L.plantarum PMO

2.2.3 乳酸菌發(fā)酵溫度的單因素實驗

不同的發(fā)酵溫度會導致發(fā)酵飲料的品質(zhì)差異很大。有的發(fā)酵溫度適合乳酸菌的生長繁殖，稱為最適生長溫度，有的發(fā)酵溫度適合乳酸菌積累代謝產(chǎn)物，稱為最適發(fā)酵溫度。有些乳酸菌會在不同的發(fā)酵溫度積累不同的代謝產(chǎn)物［24-26］。由圖4(a)可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵后活菌數(shù)對數(shù)值呈逐漸減少的趨勢，發(fā)酵溫度從35℃到37℃，活菌數(shù)對數(shù)值減少程度不明顯，而發(fā)酵溫度從37℃到43℃，活菌數(shù)減少程度明顯;隨著發(fā)酵溫度的升高，總黃酮含量變化不明顯，可見菌種發(fā)酵溫度對飲料的總黃酮的含量無影響。

圖3 菌種接種量對植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的影響Fig.3 Effect of the amount of inoculated for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由圖4(b)可知，隨著菌種發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵后總酸含量呈先增加后下降的趨勢，發(fā)酵溫度從35℃到37℃，總酸含量增加，而發(fā)酵溫度從37℃到43℃，總酸含量逐漸降低，降低趨勢明顯;pH呈先下降后逐漸升高的趨勢，發(fā)酵溫度從35℃到37℃ pH略有下降，而發(fā)酵溫度從37℃到43℃，pH上升明顯。

由圖由圖4(c)可知，隨著菌種發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵飲料感官評分呈先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵溫度為37℃時感官評分最高。綜合以上可見37℃時菌種產(chǎn)酸最多，且產(chǎn)生的酸有利于發(fā)酵風味的形成，因此菌種的最適發(fā)酵為37℃。

2.2.4 乳酸菌發(fā)酵時間的單因素實驗

由圖5(a)可知，隨著發(fā)酵時間的延長，活菌數(shù)對數(shù)值呈先增加，再趨于平穩(wěn)后下降的趨勢，即在12～16 h期間，菌種處于生長穩(wěn)定期，活菌數(shù)量最高。隨著發(fā)酵時間的延長，總黃酮含量呈減少的趨勢，但減少的趨勢較弱，可能是隨著時間的延長，黃酮被氧化，但黃酮在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，乳酸菌代謝產(chǎn)生的酸對黃酮起了一定的保護作用。

圖4 發(fā)酵溫度對植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由圖5(b)可知，隨著時間的延長，總酸逐漸增加，在0～12 h時，乳酸菌處于延滯期和對數(shù)期，產(chǎn)酸較少，在12～16 h時乳酸菌處于穩(wěn)定期，產(chǎn)酸較多，在16～20 h時，乳酸菌開始衰亡，產(chǎn)酸較少，總酸增加較少。由于酸的含量越來越多，pH則與總酸相反，呈逐漸下降的趨勢。

由圖5(c)可知，隨著時間的延長，由于乳酸菌的代謝產(chǎn)物種類和含量的不同，發(fā)酵飲料的感官評分呈先升高后降低的趨勢，在發(fā)酵14 h時感官評分最高。綜合以上，選擇發(fā)酵時間為14 h。

2.2.5 糖添加量的單因素實驗

由圖6(a)可知，隨著糖添加量的增加，活菌數(shù)對數(shù)值呈先增多再減少的趨勢，在糖添加比例為7%時活菌數(shù)量較高。總黃酮含量不隨糖添加比例的變化而變化。

由圖6(b)可知，隨著糖添加量的增加，總酸逐漸增加，在糖添加量為7%時增加較少，后趨于平穩(wěn)。pH逐漸降低，在糖添加量為7%時降低較少，后趨于平穩(wěn)。

圖5 發(fā)酵時間對植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的影響Fig.5 Effect of fermentation time for the fermented beverages of L.plantarum PMO

由圖6(c)可知，發(fā)酵飲料的感官評分隨糖添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，在糖添加量為6%和7%時都較高，在7%時最高。綜合考慮，糖添加量為7%時最優(yōu)。

2.3 正交試驗

由于總酸含量會影響發(fā)酵飲料的感官品質(zhì)，總酸含量并非越高越高，pH變化與總酸含量變化呈負相關(guān)，總黃酮含量變化不明顯，所以選擇活菌數(shù)對數(shù)值和感官評分為正交試驗測定指標。試驗結(jié)果見表4。在影響活菌數(shù)對數(shù)值和感官評分的4個因數(shù)中，按主次順序排列為B＞D＞C＞A，即溫度對活菌數(shù)的影響最為重要，糖添加量次之，時間和接種量影響較小。最優(yōu)組合為A2B2C1D2，即在接種量為3%，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為12 h，糖添加量為7%時發(fā)酵飲料的活菌數(shù)最高。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 The results of orthogonal experiment

圖6 糖添加量對植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的影響Fig.6 Effect of the amount of sugar for the fermented beverages of L.plantarum PMO

2.4 驗證實驗

根據(jù)正交試驗優(yōu)化得到的最優(yōu)組合A2B2C1D2，即在接種量為3%，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為12 h，糖添加量為7%進行驗證實驗，測定活菌數(shù)對數(shù)值為8.584，感官評分為88，此時加權(quán)值為90。因此最優(yōu)組合為A2B2C1D2，最佳發(fā)酵條件為:接種量3%，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時間12 h，糖添加量7%。

3 結(jié)論

從綜合分析的結(jié)果得出，影響活菌數(shù)對數(shù)值和感官評分的因素的主次順序為:發(fā)酵溫度＞糖添加量＞發(fā)酵時間＞菌種接種量。植物乳桿菌PMO菌種發(fā)酵飲料的發(fā)酵條件為:接種量為3%，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵時間為12 h，糖添加量為7%。

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