謝昕，呂曉騰，楊英歌，黃繼翔

1(徐州生物工程職業(yè)技術學院生物工程系，江蘇徐州，221006)

2(德州昂立達生物技術有限公司，山東德州，253000)

機體在氧化過程中會產(chǎn)生多種自由基和其他活性氧，當自由基產(chǎn)生過多，超過機體對自由基的清除能力時，多余的自由基會導致DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子的氧化損傷，與機體衰老和多種疾病的發(fā)生與發(fā)展有密切聯(lián)系［1］。以大豆或豆粕為原料經(jīng)微生物發(fā)酵提高其抗氧化能力或分離鑒定抗氧化成分已有較多研究，所使用的微生物種類包括霉菌、酵母、細菌等［2］。以枯草芽孢桿菌為代表的芽孢桿菌是研究較多的微生物類群之一，其種類多樣且不同來源菌株的代謝多樣性高，可產(chǎn)生抗氧化肽［3］、異黃酮類［4］、維生素 E［5］、糖蛋白［6］、胞外多糖［7］、硫醇類化合物［8］、多酚［9］等多種類型的抗氧化物質(zhì)，是一類有良好應用前景的微生物類群。

芽孢桿菌是自然發(fā)酵豆豉中的優(yōu)勢菌群［10］，我們從不同來源的自然發(fā)酵豆豉中分離純化芽孢桿菌菌株，使用多種抗氧化性評價方法對菌株發(fā)酵豆粕上清液的抗氧化能力進行測量，對菌株及其抗氧化特性的多樣性進行分析，為基于大豆或豆粕的功能性成分的開發(fā)提供菌株資源。

1 材料和方法

1.1 菌株的分離純化

本試驗室保存的43份自然發(fā)酵豆豉樣品，稱取10 g樣品，分散在90 mL無菌生理鹽水中，劇烈振蕩并梯度稀釋后涂布LB平板，37℃培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)有差異的不同菌落在LB平板上多次劃線純化，鏡檢確認產(chǎn)生芽孢后將菌株接種至LB斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株篩選

1.2.1 發(fā)酵上清液制備

本地市售豆粕(凱氏定氮法測含氮量7.46%，含水量8.72%)粉碎并過100目篩。豆粕培養(yǎng)基:豆粕粉0.1 g/mL，蒸餾水余量，300 mL錐形瓶裝液量75 mL，1×105Pa滅菌15 min。所保存菌株在LB液體培養(yǎng)基活化48 h后以體積比為3%的接種量接種，37℃，180 r/min振蕩液培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，取上清用于后續(xù)試驗。

1.2.2 初篩1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)清除率測定

［11］有改動。發(fā)酵上清液1.0 mL與0.04 mol/mL DPPH乙醇溶液3.0 mL混合，避光靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，測517 nm吸光度。以無水乙醇為空白對照。每個菌株重復測定3次。

1.3 復篩

1.3.1 羥基自由基(·OH)清除率測定

按參考文獻［6］有改動，稀釋10倍的發(fā)酵上清液1.0 mL，與6 mmol/L FeSO40.3 mL、6 mmol/L 水楊酸1.5 mL、雙蒸水2.0 mL混合并搖勻，加入6 mmol/L H2O20.3 mL啟動反應，室溫靜置10 min測510 nm吸光度。以雙蒸水為空白對照。每個菌株重復測定3次。

1.3.2 超氧陰離子自由基(·O2-)清除率測定

按參考文獻［6］有改動。取pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液3.0 mL，置于25℃水浴中預熱20 min，與稀釋10倍的發(fā)酵上清液1.0 mL和30 mmol/L鄰苯三酚溶液0.6 mL混勻后，25℃水浴中保溫5 min，加入1 mol/L HCl 0.5 mL終止反應，于420 nm處測定吸光值。以雙蒸水為空白對照。每個菌株重復測定3次。

1.3.3 總抗氧化力測定

使用鉬酸銨法［12］。稀釋10倍的發(fā)酵上清液1.0 mL，與 0.6 mol/L H2SO4、28 mmol/L Na3PO4、4 mmol/L鉬酸銨溶液各1.0 mL混勻，95℃水浴60 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心10 min后取上清液，測695 nm處吸光值，吸光值越大則樣品抗氧化能力越強。每個菌株重復測定3次。

1.3.4 Fe3+還原能力測定

按參考文獻［12］有改動。稀釋10倍的發(fā)酵上清液1.0 mL，加入pH 6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖液2.0 mL、10 mg/mL鐵氰化鉀2.0 mL，混勻，50℃水浴20 min，加入100 mg/mL三氯乙酸2.0 mL和0.1%(W/V)FeCl3溶液1.0 mL，混勻，測700 nm吸光值，吸光值越高表明還原能力越強。每個菌株重復測定3次。

1.3.5 Fe2+螯合率測定

按參考文獻［13］有改動。稀釋10倍的發(fā)酵上清液 1.0 mL，加入 1 mmol/L FeCl2溶液 2.0 mL，5 mmol/L Ferozine溶液1.0 mL，混勻，室溫下反應10 min，測562 nm吸光值。以雙蒸水為空白。每個菌株重復測定3次。

1.3.6 脂質(zhì)過氧化抑制率測定

使用硫代巴比妥酸法，稀釋10倍的發(fā)酵上清液1.0 mL，加入0.4%(W/V)大豆卵磷脂溶液7.0 mL，加入10 mmol/L FeSO41.0 mL，混勻，37℃保溫20 min，加入20%(W/V)三氯乙酸2.0 mL，5 000 r/min離心10 min，取上清液4.0 mL，加入0.8%(W/V)硫代巴比妥酸溶液2.0 mL，混勻，沸水浴15 min，測532 nm吸光值。以雙蒸水為空白。每個菌株重復測定3次。

1.3.7 多肽濃度測定

雙縮脲法［14］。

1.4 發(fā)酵上清液抗氧化穩(wěn)定性測定

按1.2.1方法制備的菌株發(fā)酵上清液，按1.3.3方法測總抗氧化力后，放入磨口玻璃瓶內(nèi)并加滿至瓶口，具塞密封后在50℃恒溫靜置存放14 d，每隔2 d取樣測總抗氧化力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用X-Cluster聚類分析軟件［15］，對各方法所得數(shù)據(jù)進行聚類分析。

1.6 菌株鑒定

通過革蘭氏染色和芽孢染色觀察菌體形態(tài)，生理生化試驗參照文獻［16］。16S rDNA序列測定由華大基因技術有限公司完成，擴增用引物為細菌16S rDNA通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')、1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。測序結果使用balstn比對初步確定種，使用MEGA5.0對齊并做系統(tǒng)發(fā)育分析，參數(shù)為NJ法、Kimura2、Pairwise deletion。

2 結果和分析

2.1 菌株純化與初篩

從43份自然發(fā)酵豆豉樣品中分離純化產(chǎn)芽孢細菌247株，對其發(fā)酵豆粕上清液測定DPPH·清除率，除1株菌株的清除率為-1.8%外，其余246株菌株的清除率在35.4%～96.6%，分段統(tǒng)計見圖1。

圖1 發(fā)酵上清液對DPPH·清除率的菌株數(shù)量分段計數(shù)Fig.1 Thedistribution of DPPH radical scavenging activity for fermented soybean meal supernate

未接種發(fā)酵的豆粕培養(yǎng)基上清的清除率為41.2%，與此相比，有97.2%(240株)的菌株發(fā)酵豆粕后可提高其對DPPH·的清除率，77.7%(192株)的菌株清除率在60%～90%。按5%的比例挑選清除率最高的 12個菌株，其清除率在 86.2%～96.6%，進行復篩。

2.2 復篩結果分析

12株對DPPH·有高清除率的復篩菌株在另外5種抗氧化性評價方法中表現(xiàn)出不同的抗氧化能力，發(fā)酵上清液中多肽質(zhì)量濃度在1.94～10.46 mg/mL，提示12株菌株在抗氧化能力和有效成分組成上存在差異，抗氧化能力并不完全來自發(fā)酵過程中降解豆粕蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多肽。

7種抗氧化性評價方法結果及與多肽濃度間的簡單相關系數(shù)見表2，僅有總抗氧化力與·OH清除率、·O2-清除率之間具有顯著、極顯著線性正相關，脂質(zhì)過氧化抑制率與多肽濃度間有極顯著線性負相關［17］。對表2數(shù)據(jù)使用X-Cluster的UPGMA(線性)算法的聚類分析結果見圖2，·OH清除率、·O2-清除率、總抗氧化力、脂質(zhì)過氧化抑制率因所得結果具有較高相關性而聚為一群，而DPPH·清除率、Fe2+螯合率、Fe3+還原能力3種方法的測試結果聚為一群，多肽濃度與此群在相關性上更高，但無統(tǒng)計意義。各方法和多肽濃度間的線性相關性表明，對于此12株菌株，發(fā)酵上清液中多肽濃度并不是決定其抗氧化能力的關鍵性因素。

表1 復篩菌株的抗氧化評價方法測量結果Table 1 The results of antioxidant capacity methods used for secondary screening strains

表2 不同抗氧化性測試方法及多肽濃度之間的相關系數(shù)Table 2 The coefficient of correlation between different antioxidant capacity methods and peptide concentration

根據(jù)表1數(shù)據(jù)使用X-Cluster對菌株進行聚類分析，算法參數(shù)為標準差標準化、夾角余弦系數(shù)、UPGMA(線性)，結果見圖3。在夾角余弦系數(shù)為0(表示無任何相關性)水平上分為4個類群。類群1包括HFBL206、HFBL241兩個菌株，特點是 DPPH·清除率相對較高，·OH清除率、·O2-清除率、總抗氧化力、多肽濃度中等，類群2包括 HFBL230、HFBL126等4株菌株，分為a、b兩個小群，HFBL126所在小群a的·O2-清除率、總抗氧化力、Fe3+還原能力高于HFBL230所在小群b，但DPPH·清除率和多肽濃度低。類群3、類群4與類群1、類群2的主要差別為·OH清除率、·O2-清除率較低。類群3與類群4相比，DPPH·清除率、Fe3+還原能力、多肽濃度較高，而·O2-清除率、總抗氧化力較低。菌株的分群結果提示不同類群的菌株所產(chǎn)生的抗氧化成分在抗氧化機制和種類上具有多樣性。

圖2 不同抗氧化評價方法所得結果和多肽濃度的聚類分析Fig.2 Cluster analysis for results of different antioxidant capacity methods and peptide concentration

2.3 抗氧化穩(wěn)定性

12株菌株發(fā)酵上清液密封后在50℃環(huán)境存放14d內(nèi)的總抗氧化力均呈下降趨勢(表3)，活性保存率(%)在69.1%～90.4%，其中HFBL234菌株活性保存率最高，而HFBL261菌株的發(fā)酵上清存放14 d后的總抗氧化力數(shù)值為1.141，在12株菌株中最高。

圖3 菌株的聚類分析結果和各類群在測試方法上的數(shù)值范圍Fig.3 The results of cluster analysis for strains and the scales of different antioxidant assay methods

表3 菌株上清液在50℃下存放14 d前后總抗氧化力變化Table 3 The change of total antioxidant capacity for fermented soybean meal supernate stored in 50℃for 14 days

2.4 菌株鑒定

選擇50℃存放14d后總抗氧化力殘留最高的HFBL261菌株進行鑒定，其表型特性見表4，16S rDNA序列分析結果見圖4，與Bacillus subtilis的相似度在99.5%以上。鑒定HFBL261為B.subtilis。

表4 Bacillus sp.HFBL261表型性狀Table 4 The phenotypic traits of Bacillus sp.HFBL261

3 討論

已有多項研究稱大豆或豆渣經(jīng)芽孢桿菌發(fā)酵后，其抗氧化能力有顯著提高［11，18-19］。本研究中，經(jīng)初篩發(fā)現(xiàn)97%的菌株發(fā)酵豆粕后可提高其對DPPH·的清除率，提示以大豆及其加工產(chǎn)品為底物發(fā)酵產(chǎn)生抗氧化成分可能是芽孢桿菌的普遍特性。

圖4 基于16S rDNA序列構建的Bacillus sp.HFBL261與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Based on the 16S rDNA sequence to build the Bacillus sp.HFBL261 and phylogenetic tree of related strains

目前已報道的抗氧化評價方法眾多，但受限于生物體代謝系統(tǒng)的復雜性和成分多樣性，并未有公認的、可準確反映一種樣品在體內(nèi)抗氧化能力的標準方法，真實反映其抗氧化能力非常困難［20］。一般認為應同時使用多種不同機制的方法進行檢測，以提高結果的客觀性。在眾多抗氧化能力評價方法中，總氧自由基清除能力(oxygen radical absorbance capacity，ORAC)法與體內(nèi)抗氧化性有較高相關性［21］，但該方法對設備要求高且試劑較貴，不易普及。對ORAC法和其他方法進行的比較研究顯示，ORAC法與DPPH法具有較高的相關性［22］，因此選擇更易操作的DPPH法對菌株進行初篩，復篩采用多種方法進行綜合評價。復篩結果表明同一菌株在不同抗氧化評價方法中性能差異明顯，如HFBL252菌株，對DPPH·的清除率為94.4%，對·OH、·O2-清除率僅為35.5%、14.6%。其他研究也報道了類似結果，例如YANG等［23］發(fā)現(xiàn)不同家族的抗氧化肽對不同類型自由基的清除率存在明顯差異。復篩結果中，僅有總抗氧化力與·OH、·O2-清除率之間有顯著、極顯著線性正相關，脂質(zhì)過氧化抑制率與多肽濃度間有極顯著線性負相關，其他方法所測結果間無顯著的線性相關性。一種樣品在不同抗氧化評價方法中的差異源于各方法在反應機制和底物選擇性等方面的差異，導致不同方法所得結果缺乏可比性，需要使用多種評價方法來盡可能客觀地評價一種樣品的抗氧化能力。

芽孢桿菌是一個蛋白酶活力較高的類群，以富含蛋白質(zhì)的大豆、豆粕等為底物，發(fā)酵產(chǎn)物中富含多種功能性肽，因此多肽濃度與功能性間可能存在相關性。陳潔梅等［24］使用 Bacillus sp.JM3固態(tài)發(fā)酵豆粕，認為多肽濃度與總抗氧化活性間有良好相關性(r2=0.8604)。但在本研究中，多肽濃度與任何一種抗氧化評價方法結果均無顯著正相關。如HFBL234菌株，發(fā)酵上清液中多肽濃度僅為1.94 mg/mL，但對DPPH·、·OH、·O2-的清除率為89.9%、45.9%、49.2%，脂質(zhì)過氧化抑制率為83.6%。該現(xiàn)象與芽孢桿菌類群的代謝多樣性有關。芽孢桿菌是一個代謝多樣性較高的類群，除抗氧化肽外，還可產(chǎn)生異黃酮類、維生素E、糖蛋白、胞外多糖、硫醇類化合物、多酚等多種抗氧化成分。多肽濃度與抗氧化性的低相關性也與自抗氧化肽在總肽中的比例有關。并非所有的多肽都具有抗氧化性，只有具有特定氨基酸序列的多肽才具有抗氧化性，例如CHEN等［25］純化所得抗氧化肽在N端富含Val、Leu、Ile、Pro等特定氨基酸殘基。抗氧化肽在總肽中的比例會影響多肽(總肽)濃度與抗氧化性之間的相關性。

對篩選的12株菌株的聚類分析將其在0～0.2水平上分為4～5個類群，不同類群在多肽濃度和不同的抗氧化性評價方法上表現(xiàn)各異，提示其發(fā)酵豆粕產(chǎn)生的抗氧化成分在作用機制和類型上的多樣性，認為一些菌株產(chǎn)生非多肽類抗氧化成分的可能性很大，對其中活性成分的分離鑒定將是今后的研究方向。

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