田廣平，石秋艷(秦皇島市第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，秦皇島 066600;河北聯(lián)合大學附屬醫(yī)院神內(nèi)重癥室;通訊作者，E-mail:tgp 057@sohu.com)

多發(fā)性硬化(mutiple sclerosis，MS)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫性疾病，目前病因和發(fā)病機制不清，且無有效的治療藥物。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的生化、免疫學、病理學改變和臨床表現(xiàn)與多發(fā)性硬化相似，是國際公認的研究多發(fā)性硬化的經(jīng)典動物模型［1，2］。苦參素具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，本研究通過腹腔注射苦參素注射液的方法對EAE大鼠進行干預，觀察EAE大鼠發(fā)病率、神經(jīng)功能評分、病理學及脊髓MCP-1的變化，探討苦參素對EAE的治療作用及可能的機制，為其臨床治療MS提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗對象與分組

6-8周齡雌性Wistar大鼠90只，體重160-200 g，豚鼠10只，體重400-500 g，雌雄各半，以上動物購自北京維通利華實驗動物公司。采用隨機數(shù)表將Wistar大鼠隨機分為正常對照組(n=30)、EAE模型組(n=30)和苦參素治療組(n=30)。每組取免疫后第7天、第14天、第21天3個觀察時間點(相當于發(fā)病初期、高峰期及緩解期)，每個時間點10只大鼠。

1.2 藥品和試劑

苦參素注射液購自浙江普洛康裕天然藥物有限公司;不完全福氏佐劑購自美國Sigma公司;卡介苗購自北京生物制品研究所;兔抗大鼠單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司;二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 EAE模型制備及藥物干預

參照徐玉等［3］的方法，應用新鮮豚鼠全脊髓勻漿+完全福氏佐劑制成完全抗原，注射到模型組及苦參素治療組大鼠四肢足墊皮下(按0.1 ml/足墊)建立EAE模型，正常對照組注射等量生理鹽水。自免疫后當天起，苦參素治療組大鼠給予腹腔注射苦參素注射液150 mg/(kg·d)，EAE模型組大鼠給予腹腔注射生理鹽水5 ml/(kg·d)，用藥持續(xù)到大鼠處死當天停用。正常對照組不給予干預。

1.4 臨床神經(jīng)功能評分

免疫后當天開始每天早、晚2次觀察大鼠一般情況并進行神經(jīng)功能評分［4］:0分，無異常表現(xiàn);1分，尾部無力;2分，尾部和后肢無力;3分，后肢癱瘓;4分，雙后肢嚴重癱瘓+前肢無力，被動翻身時不能復原;5分，全身癱瘓、瀕臨死亡或死亡。

1.5 標本取材

各組大鼠分別于免疫后第7，14，21天處死，取脊髓腰膨大處用4%多聚甲醛固定12 h，常規(guī)石蠟包埋，間隔50 μm間斷切取6張切片，HE染色和免疫組化檢測各用3張。

1.6 病理學觀察

切片常規(guī)HE染色后置于100倍光鏡下觀察，以小血管周圍呈現(xiàn)袖套樣炎細胞浸潤或超過15-20個炎細胞成簇浸潤者為1個炎性病灶進行計數(shù)，每張切片隨機計數(shù)5個不重疊視野，將每只大鼠15個視野炎性病灶相加后取平均數(shù)進行統(tǒng)計學處理。

1.7 脊髓MCP-1水平檢測

應用兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體及二抗試劑盒、DAB顯色劑等對脊髓切片行免疫組化染色，在200倍光鏡下觀察，在白質(zhì)區(qū)隨機觀測5個不同視野，采用Ipp6.0軟件對MCP-1染色強度進行定量分析，結果用平均灰度值表示(灰度值是反映透光密度的定量指標，與蛋白表達量呈負相關，灰度值越低，蛋白表達量越多;反之亦然)。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠發(fā)病情況及神經(jīng)功能評分

各組大鼠無死亡。正常對照組大鼠全程無發(fā)病，活動正常。免疫后7-9 d EAE模型組及苦參素治療組大鼠均發(fā)病，表現(xiàn)為體重減輕，尾部及肢體無力、爬行緩慢等，免疫后第14 d左右癥狀達高峰，發(fā)病嚴重大鼠表現(xiàn)為雙后肢或四肢癱瘓，總病程持續(xù)9-12 d，多在免疫后21 d緩解。EAE模型組和苦參素治療組發(fā)病率分別為100%和47%?？鄥⑺刂委熃M大鼠的發(fā)病率和發(fā)病不同時間點神經(jīng)功能評分均低于EAE模型組(P＜0.05，見表1)。

表1 實驗各組不同時間點神經(jīng)功能評分比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of neurological scores among three groups at different time points(±s，n=10)

表1 實驗各組不同時間點神經(jīng)功能評分比較(±s，n=10)Table 1 Comparison of neurological scores among three groups at different time points(±s，n=10)

與正常對照組比較，△P＜0.05;與EAE模型組比較，#P ＜0.05

組別 第7天 第14天 第21天正常對照組0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 0.0 ±0.0 EAE 模型組 1.1 ±0.5△ 3.9 ±1.1△ 1.3 ±0.7△苦參素治療組 0.4 ±0.5# 1.1 ±0.6# 0.6 ±0.7#

2.2 病理學觀察

鏡下顯示正常對照組大鼠脊髓組織無炎性細胞浸潤。EAE及苦參素治療組大鼠脊髓白質(zhì)中，大量炎細胞浸潤在小血管周圍，典型呈現(xiàn)的“袖套”樣改變，或大量炎細胞成簇浸潤(圖1，見第608頁)。與EAE模型組比較，苦參素治療組的炎性病灶數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，見表2)。

圖1 實驗各組第14天時脊髓白質(zhì)內(nèi)炎癥細胞浸潤情況 (HE染色，×100)Figure 1 Inflammatory cells infiltrated in spinal cord in different groups at 14 d (HE staining，×100)

表2 實驗各組不同時間點炎性病灶數(shù)比較(±s，n=10)Table 2 Com parison of the number of inflammatory focus among three groups at different time points(±s，n=10)

表2 實驗各組不同時間點炎性病灶數(shù)比較(±s，n=10)Table 2 Com parison of the number of inflammatory focus among three groups at different time points(±s，n=10)

與同時間點正常對照組比較，△P＜0.05;與同時間點EAE模型組比較，#P ＜0.05

組別 第7天 第14天 第21天正常對照組0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 EAE 模型組 1.76 ±0.77△ 3.43 ±1.17△ 2.20 ±0.48△苦參素治療組 0.00 ±0.00# 1.33 ±0.66△# 0.86 ±0.63△#

2.3 脊髓MCP-1水平比較

MCP-1表達陽性細胞主要為星型膠質(zhì)細胞，表現(xiàn)為胞質(zhì)著色，呈棕褐色(圖2，見封3)。正常對照組大鼠脊髓內(nèi)MCP-1陽性細胞少，染色較淺。與正常對照組比較，EAE模型組大鼠脊髓MCP-1灰度值在免疫后第7天時即降低，第14天時降低更加顯著，第21天時升高。與同時間點EAE模型組相比，苦參素治療組MCP-1灰度值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，說明苦參素治療組MCP-1的陽性表達較EAE模型組大鼠降低(見表3)。

3 討論

苦參素是從中藥苦參、苦豆子或廣豆根中提取的一種喹嗪啶類生物堿，其中氧化苦參堿的含量＞98%，具有抗病毒、抗炎和抑制自身免疫反應等藥理 作用［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)，苦參素可以減輕EAE大鼠的癥狀，對EAE有明顯的防治作用［7］。本研究顯示與EAE模型組大鼠比較，苦參素治療組大鼠的發(fā)病率和神經(jīng)功能評分降低，脊髓病理學改變減輕，提示苦參素可以抑制EAE大鼠的炎癥反應，減輕神經(jīng)功能損傷的程度，促進臨床癥狀的緩解，這一研究與國內(nèi)報道相符［8］。

表3 實驗各組不同時間點MCP-1平均灰度值比較(±s，n=10)Table 3 Com parison of the average gray of positive staining of MCP-1 among three groups at different time points(±s，n=10)

表3 實驗各組不同時間點MCP-1平均灰度值比較(±s，n=10)Table 3 Com parison of the average gray of positive staining of MCP-1 among three groups at different time points(±s，n=10)

與正常對照組比較，△P＜0.05;與EAE模型組比較，#P＜0.05

組別 第7天 第14天 第21天正常對照組177.48 ±10.83 171.73 ±12.04 174.42 ±11.76 EAE 模型組 149.06 ±6.09△ 128.24 ±7.72△ 148.17 ±7.71△苦參素治療組 176.33 ±7.85# 147.98 ±9.33# 164.78 ±9.15#

EAE是由抗原特異性CD4+T細胞介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身統(tǒng)免疫性疾病。CD4+T細胞通過血腦屏障向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移并進一步破壞髓鞘及軸索是EAE發(fā)病的關鍵步驟，血腦屏障附近表達上調(diào)的一些免疫介質(zhì)如趨化因子、黏附分子、金屬蛋白酶等細胞因子對這一遷移過程起著重要的調(diào)控作用［8］。趨化因子通過與受體結合介導免疫細胞活化并向特定組織浸潤、積聚。MCP-1由76個氨基酸組成，屬于CC類趨化因子家族，主要與CC類趨化因子受體2結合，是引起單核細胞、巨噬細胞及活化淋巴細胞聚集的重要的趨化因子［10］。MCP-1在EAE中的表達水平明顯升高，并且與EAE的臨床癥狀密切相關［11］。研究發(fā)現(xiàn)在EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)MCP-1的表達水平和動態(tài)變化與臨床表現(xiàn)一致，提示 MCP-1是 EAE 發(fā)病中關鍵的致炎因子［12，13］。本研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病初期，EAE大鼠脊髓MCP-1的表達上調(diào)，在癥狀高峰期MCP-1表達水平升高更加明顯，緩解期下降。經(jīng)苦參素干預后 EAE大鼠MCP-1表達水平明顯下降，提示苦參素可以降低EAE大鼠MCP-1的表達，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的炎癥反應。

本研究證實，苦參素可以降低EAE的發(fā)病率，減輕脊髓內(nèi)炎癥反應，從而緩解EAE的臨床癥狀。苦參素對EAE的治療作用可能與其下調(diào)EAE大鼠脊髓內(nèi)MCP-1的表達水平有關。

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