武 峰，馮振明，康 仟，田國(guó)兵(山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，太原 0000;山東省東營(yíng)市市直機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科;山西省人民醫(yī)院口腔內(nèi)科;通訊作者，E-mail:tianguobing007@6．com)

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能息息相關(guān)，當(dāng)腫瘤發(fā)生后，機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)腫瘤抗原的特異性免疫應(yīng)答，其中體液免疫發(fā)揮著重要的作用，而B淋巴細(xì)胞的基本功能是當(dāng)機(jī)體受抗原刺激后參與體液免疫，此外，B細(xì)胞還能代替樹突狀細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞(APC)參與腫瘤免疫應(yīng)答［1］。因此本研究利用DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠鱗狀細(xì)胞癌荷瘤模型，在此腫瘤模型的基礎(chǔ)上分組并進(jìn)行藥物干預(yù)，通過測(cè)定各組小鼠外周血中B淋巴細(xì)胞的含量，從而分析OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗如何激活機(jī)體對(duì)腫瘤的體液免疫應(yīng)答，為尋找OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗可能的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)，同時(shí)為鱗狀細(xì)胞癌的免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1．1 瘤株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KLN-205細(xì)胞株(DBA/2小鼠來(lái)源的肺癌細(xì)胞)，購(gòu)自上海愛丁堡生物科技發(fā)展有限公司。KLN-205腫瘤細(xì)胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養(yǎng)，選取培養(yǎng)4代以上活力旺盛的腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞。雌性DBA/2小鼠75只，清潔級(jí)，7周齡，約(20±2)g，購(gòu)自北京維通利華科技有限公司。

1．2 制備疫苗和建立模型

采用Li等［2］的方法，用戊二醛(GA)作為橋連劑將OK-432與KLN-205細(xì)胞結(jié)合，制成OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗。參照Bollag［3］的實(shí)驗(yàn)方法并略加改動(dòng)，采用 7，12－二甲基苯蒽(DMBA)/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠皮膚癌荷瘤模型。

建模具體方法如下:①實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備:在涂DMBA前1 d用脫毛劑處理所有小鼠背部皮膚的相同部位，范圍大小約2 cm×3 cm。注意脫毛劑停留的時(shí)間，防止對(duì)小鼠背部皮膚造成灼傷。②實(shí)驗(yàn)始發(fā)階段:實(shí)驗(yàn)第1，7，14天，將配置好的 DMBA丙酮液(150 μg/200 μl)涂抹于脫去毛發(fā)后小鼠暴露的背部皮膚，每只涂抹200 μl。③實(shí)驗(yàn)促癌階段:第5周起，于每周二、周五，在小鼠暴露的背部皮膚的相同部位涂抹0．25%巴豆油丙酮液，每只涂抹200 μl。定時(shí)觀察腫瘤發(fā)生發(fā)展的情況和荷瘤鼠數(shù)。④造模時(shí)間:造模時(shí)間總共為18周。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組及B細(xì)胞檢測(cè)

選取48只長(zhǎng)出腫瘤的荷瘤小鼠隨機(jī)分為3組:OK-432疫苗組、OK-432組和空白對(duì)照組，每組16只。各組小鼠于左側(cè)腹腔分別注射濃度為5×105個(gè)/100 μl的 OK-432 腫瘤細(xì)胞疫苗 100 μl，0．7 KE(OK-432 計(jì)量單位)/100 μl的 OK-432 100 μl，PBS液100 μl，每周注射1次，連續(xù)注射3周。于末次注射后第1，3，7，14天，每組隨機(jī)選擇4只 DBA/2小鼠進(jìn)行眼球采血，流式細(xì)胞術(shù)中利用APC熒光素標(biāo)記抗小鼠CD45R/B220單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)BD公司)檢測(cè)小鼠外周血中B細(xì)胞含量。

1．4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

末次注射藥物后第 1，3，7，14 天，OK-432 疫苗組小鼠外周血中B淋巴細(xì)胞含量變化的總趨勢(shì)為:第1天到第3天時(shí)上升較平緩;第7天時(shí)明顯升高，第14天時(shí)較第7天有所降低，且在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)較空白對(duì)照組和OK-432組均明顯升高(P＜0．05);OK-432組與空白對(duì)照組前3 d差異不明顯(P＞0．05)，第7天和第14天時(shí)較空白對(duì)照組明顯增高(P＜0．05，見表1、圖1)。

表1 末次給藥后14 d內(nèi)小鼠外周血中B細(xì)胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

表1 末次給藥后14 d內(nèi)小鼠外周血中B細(xì)胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

與空白對(duì)照組相比，*P ＜0．05;與 OK-432組對(duì)比，#P ＜0．05

組別 第1天 第3天 第7天 第14天空白對(duì)照組 28．78 ±0．81 30．20 ±1．13 30．15 ±1．10 32．77 ±0．70 OK-432 組 29．26 ±1．04 30．32 ±0．84 39．59 ±1．43* 39．65 ±0．74*OK-432 疫苗組 31．90 ±1．65*# 34．04 ±1．09*# 42．80 ±0．65*# 42．30 ±0．97*#

圖1 小鼠外周血中B淋巴細(xì)胞含量變化趨勢(shì)圖Figure 1 The changes of the content of the B lymphocytes in peripheral blood in mice

3 討論

OK-432(Picibanil)為細(xì)菌類非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，已經(jīng)大量應(yīng)用于臨床良、惡性腫瘤的治療，并具有良好的安全性，包括口腔癌。KLN-205細(xì)胞源于DBA/2小鼠的鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，通過架橋劑戊二醛把KLN-205細(xì)胞和OK-432結(jié)合形成自體腫瘤細(xì)胞疫苗，不僅帶有腫瘤組織所具有的免疫原性和特異性，還具有和正常組織相同的相關(guān)白細(xì)胞抗原，不會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。OK-432腫瘤疫苗是利用OK-432直接殺傷癌細(xì)胞的作用，通過菌體與癌細(xì)胞的直接接觸，使腫瘤細(xì)胞變性并暴露瘤細(xì)胞“隱藏”著的某些抗原決定簇，從而達(dá)到增強(qiáng)腫瘤抗原性的目的［2］。

癌癥的發(fā)生一般分為始發(fā)階段、促癌階段和演化階段。本研究首先利用DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠鱗狀細(xì)胞癌荷瘤模型。DMBA是一種多環(huán)芳香烴，單獨(dú)應(yīng)用可誘導(dǎo)倉(cāng)鼠頰囊癌變［4］，也可以誘導(dǎo)大鼠乳腺癌［5］等腫瘤的發(fā)生。巴豆油中富含12-O－十四烷酰佛波醇－13－乙酯(TPA)類物質(zhì)，F(xiàn)u等［6］研究表明當(dāng)其作用于皮膚組織會(huì)導(dǎo)致皮膚組織中大量的巨噬細(xì)胞滲出，出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，同時(shí)伴有活性氧自由基的釋放，在促癌過程中起著重要的作用。因此，DMBA/巴豆油二階段法誘癌過程與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展相似，說(shuō)明DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立的DBA/2小鼠鱗狀細(xì)胞癌荷瘤模型是一種較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是與機(jī)體的免疫息息相關(guān)的。當(dāng)腫瘤發(fā)生以后，機(jī)體可針對(duì)腫瘤抗原產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，但隨著腫瘤的發(fā)生發(fā)展，機(jī)體的免疫功能就受到抑制［7］。我們采用主動(dòng)免疫治療，以期增加腫瘤抗原的免疫原性，克服免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能?？偟膩?lái)說(shuō)，機(jī)體的免疫分為細(xì)胞免疫和體液免疫，在本實(shí)驗(yàn)中主要探討體液免疫的作用，B細(xì)胞在體液免疫中通過活化為漿細(xì)胞，進(jìn)而分泌抗體來(lái)達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的。因此，本實(shí)驗(yàn)在DBA/2小鼠腫瘤模型的基礎(chǔ)上，通過分組藥物干預(yù)，測(cè)定小鼠外周血中B淋巴細(xì)胞從而判斷OK－432腫瘤細(xì)胞疫苗的治療作用。

CD45R/B220是小鼠B細(xì)胞最常用的表面標(biāo)記，該抗原的分布具有限制性，主要表達(dá)在B細(xì)胞(包括前B細(xì)胞)上，也有少部分表達(dá)于T細(xì)胞和單核細(xì)胞。B細(xì)胞可能通過以下途徑參與腫瘤免疫:(1)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫:主要通過分泌IgM、IgG、IgG2b等抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)，Li等［8］研究表明，B 細(xì)胞分泌的IgG2b抗體對(duì)MCA205腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生抗腫瘤作用;(2)作為抗原提呈細(xì)胞(APC):B細(xì)胞除產(chǎn)生抗體以外還有一個(gè)重要的功能——提呈抗原，而且經(jīng)CD40活化的B細(xì)胞對(duì)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞所不能有效攝取的可溶性抗原仍能通過內(nèi)化加工提呈給T細(xì)胞［9］。本實(shí)驗(yàn)中OK-432疫苗組在末次注射疫苗后第1、3、7、14天時(shí)，外周血中的B細(xì)胞含量較空白對(duì)照組和OK-432組均有明顯升高(P＜0．05)，說(shuō)明OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗能增加B細(xì)胞的含量，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，且較單獨(dú)應(yīng)用OK-432效果好。

綜上所述，OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗可以增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，克服免疫抑制狀態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。但目前OK-432腫瘤細(xì)胞疫苗具體的抗腫瘤作用機(jī)制仍不明確，這有待于進(jìn)一步的研究。

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