龐驍霄 李麗 馬利 鄭謙 李承浩

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院唇腭裂外科（四川大學(xué)），成都 610041

非綜合征型唇腭裂是頜面部最常見(jiàn)的先天性發(fā)育畸形，其病因復(fù)雜，目前認(rèn)為與基因和環(huán)境因素有關(guān)。環(huán)境因素中如糖皮質(zhì)激素類、四氯二苯對(duì)二惡英等均可誘發(fā)先天性腭裂。地塞米松（dexamethasone，DEX）作為糖皮質(zhì)激素家族中的一員，具有較高的致畸風(fēng)險(xiǎn)，但具體致畸機(jī)制目前尚未清楚。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，在正常腭融合過(guò)程中，腭突上皮細(xì)胞中E-鈣黏素（E-cadherin）的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致腭中嵴上皮縫（medline epithelial seam，MES）裂解并形成上皮島，最終完成腭突融合。E-cadherin是一種重要的黏附分子，在上皮融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)注射DEX于孕鼠腹膜下，研究DEX作用下腭突中E-cadherin基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討DEX對(duì)腭突發(fā)育的影響及導(dǎo)致腭裂的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡C57BL/6J小鼠（購(gòu)自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），質(zhì)量25～30 g，雌雄分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由攝食飲水，給予充足食物。飼養(yǎng)房的溫度為20～25 ℃，分別給予光照與黑夜12 h，相對(duì)濕度20%～30%。雌雄合籠過(guò)夜，比例為2∶1，于晚18:00合籠，并于次日早7:30檢查雌性小鼠的陰栓，查見(jiàn)陰栓之日定為孕0 d（embryonic day，E0），稱重放入空籠飼養(yǎng)并做好記錄。對(duì)E10.0的小鼠再次稱重，如體重增加2 g以上則確定懷孕。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材 生理鹽水（normal sodium，NS）（湖南科倫制藥公司），DEX（Sigma公司，美國(guó)），兔抗鼠E-cadherin抗體和試劑盒（ZYMED公司，美國(guó)）等。體視顯微鏡、光學(xué)顯微鏡，由四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 孕鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組孕鼠于E10.0—E12.0每天稱重后分別于腹膜下注射DEX和NS，DEX劑量為6 mg·kg-1，NS為每只0.1 mL。

1.2.2 標(biāo)本獲取及染色 在E13.5、E14.5、E15.5、E17.5用頸椎脫臼法處死孕鼠，無(wú)菌環(huán)境中取出胚胎。將胎鼠頭部通過(guò)脫水、透明、浸蠟及包埋制成5 μm厚切片，切片脫蠟水化。對(duì)標(biāo)本行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光鏡下觀察腭部的組織學(xué)變化。孵化兔抗小鼠E-cadherin抗體對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用SABC法，抗體稀釋度為1∶200，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染，透明后經(jīng)中性樹(shù)膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，real-time PCR）定量分析 體視顯微鏡下剪取E14.0、E14.5、E15.5的胎鼠腭突，置液氮中保存，將胎鼠腭突組織勻漿，用Trizol試劑提取組織中的總RNA，利用SYBR Premix Ex TapTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司，日本）進(jìn)行real time-PCR，對(duì)E-cadherin和β-鈣黏素（β-catenin）mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為目的基因的CT值參照。引物序列見(jiàn)表1。real-time PCR反應(yīng)在ABI PRISM 7300系統(tǒng)（ABI公司，美國(guó)）中進(jìn)行，反應(yīng)條件：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 DEX誘導(dǎo)腭裂發(fā)生的情況

DEX組胎鼠共39只，17只出現(xiàn)腭裂，22只腭突融合，腭裂發(fā)生率為43.59%（17/39）；對(duì)照組胎鼠共33只，1只出現(xiàn)腭裂，32只腭突融合，腭裂發(fā)生率為3.03%（1/33）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，2組的腭裂發(fā)生率有明顯差異（P＜0.05），DEX組明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明DEX具有較高的致畸性。

2.2 HE染色觀察

對(duì)照組和DEX組胎鼠的腭部形態(tài)如圖1所示。E13.5，對(duì)照組胚胎舌體開(kāi)始下降，腭突開(kāi)始上抬并沿舌體兩側(cè)垂直向下生長(zhǎng)；而DEX組胚胎舌體位置較高。E14.5，對(duì)照組舌體降至口底，兩側(cè)腭突上抬至舌體上方呈水平位，腭中嵴上皮在中線區(qū)形成MES；DEX組腭突位于舌體兩側(cè)開(kāi)始上抬，上抬不規(guī)律且短小，兩側(cè)腭突不接觸。E15.5，對(duì)照組MES消失，間充質(zhì)細(xì)胞相互連接形成完整的腭突；DEX組腭突在舌體上方呈水平生長(zhǎng)，兩側(cè)腭突體積短小，不能在中線區(qū)相互接觸致形成腭裂。E17.5，對(duì)照組腭部發(fā)育基本完成，DEX組腭突短小，不能與鼻中隔完全接觸，腭裂形成。

圖1 對(duì)照組和DEX組胎鼠在不同時(shí)間的腭部形態(tài) HE × 100Fig 1 Palate morphology of the mouse in the control and DEX groups at different time HE × 100

2.3 免疫組織化學(xué)染色觀察

E-cadherin在腭突主要表達(dá)于上皮中，其染色陽(yáng)性部位在細(xì)胞膜上。對(duì)照組和DEX組胎鼠的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見(jiàn)圖2：以細(xì)胞膜染成淡黃色或棕褐色者作為陽(yáng)性細(xì)胞，可見(jiàn)E-cadherin在細(xì)胞膜中高表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核未檢測(cè)到明顯的表達(dá)。E13.5時(shí)，對(duì)照組腭突上皮呈現(xiàn)棕黃色，間充質(zhì)中未見(jiàn)明顯棕黃色出現(xiàn)，DEX組腭突上皮中呈現(xiàn)棕黃色染色，但其間充質(zhì)中有少量散在的棕黃色存在；E14.5，對(duì)照組兩側(cè)腭突上提，在舌體上方呈水平相對(duì)，中線區(qū)可見(jiàn)一條棕黃色的上皮中縫，同時(shí)在口腔側(cè)及鼻腔側(cè)上皮兩腭突接觸區(qū)域呈現(xiàn)三角形棕黃色區(qū)域；DEX組兩側(cè)腭突相距較遠(yuǎn)，單側(cè)腭突上皮表面呈現(xiàn)明顯的棕黃色，同時(shí)觀察到腭突間充質(zhì)中出現(xiàn)散在棕黃色區(qū)域。E15.5，對(duì)照組兩側(cè)腭突完全融合，中縫區(qū)未見(jiàn)棕黃色染色，僅在口腔上皮及鼻側(cè)上皮呈現(xiàn)棕黃色；DEX組兩側(cè)腭突相對(duì)但不融合，腭突間充質(zhì)中散在棕黃色區(qū)域。E17.5，對(duì)照組腭突間充質(zhì)未發(fā)現(xiàn)明顯棕黃色區(qū)域，而DEX組腭突間充質(zhì)顯示有明顯的棕黃色染色。

圖2 E-cadherin在對(duì)照組和DEX組腭突上皮中的表達(dá) SABC × 100Fig 2 E-cadherin expression in palatogenesis of the control and DEX groups SABC × 100

2.4 real-time PCR定量分析

E-cadherin和β-catenin mRNA在對(duì)照組和DEX組的表達(dá)量見(jiàn)圖3。E14.0，DEX組小鼠腭突中的E-cadherin的表達(dá)水平約為對(duì)照組的2.5倍，β-catenin約為對(duì)照組的2.4倍。E14.5，E-cadherin的表達(dá)水平明顯增加，增至對(duì)照組的9.0倍，β-catenin增至對(duì)照組的9.2倍。E15.5，E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，但表達(dá)量仍約為對(duì)照組的1.9倍，β-catenin的表達(dá)也下調(diào)，但表達(dá)量仍為對(duì)照組的2.2倍。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，E-cadherin及β-catenin在DEX組與對(duì)照組表達(dá)量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 β-catenin（上）和E-cadherin（下）mRNA在對(duì)照組和DEX組的表達(dá)差異Fig 3 The differences of β-catenin (top) and E-cadherin (bottom)expression between the control and DEX groups

3 討論

哺乳動(dòng)物腭部發(fā)育過(guò)程中，腭突上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞需要相互協(xié)調(diào)、相互誘導(dǎo)[2]，兩側(cè)腭突垂直生長(zhǎng)、上抬、接觸、融合形成腭，在此過(guò)程中任何干擾因素都有可能影響其正常發(fā)育而導(dǎo)致腭裂。在正常腭發(fā)育過(guò)程中，當(dāng)兩側(cè)腭突接觸后，腭突上皮細(xì)胞E-cadherin的表達(dá)受到抑制，腭突上皮細(xì)胞E-cadherin表達(dá)減少，導(dǎo)致MES裂解并形成上皮島，最終完成腭突的融合[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)DEX處理后，兩側(cè)腭突體積明顯縮小，腭突上抬延緩，導(dǎo)致兩側(cè)腭突不能接觸融合，進(jìn)一步驗(yàn)證了本課題組之前的研究[3-4]結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)E-cadherin在腭突間充質(zhì)中異位表達(dá)。E-cadherin是一種依賴于鈣離子的細(xì)胞間黏附分子，屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，幾乎表達(dá)于所有上皮組織，是一種重要的細(xì)胞黏附分子和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對(duì)于胚胎發(fā)育和細(xì)胞轉(zhuǎn)歸過(guò)程等具有重要作用[5-6]。E-cadherin能夠促進(jìn)細(xì)胞間的連接，維持細(xì)胞骨架和連接支架的穩(wěn)定，許多轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、E12/E47、Sip-1（smad-interacting protein 1）、Zeb-1（zinc finger E-box binding homeobox 1）和Twist可通過(guò)直接或者間接抑制E-cadherin的表達(dá)導(dǎo)致上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。β-catenin與E-cadherin在細(xì)胞膜內(nèi)表面結(jié)合形成E-cadherin/β-catenin復(fù)合體，可以維持細(xì)胞間黏附并調(diào)控β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)水平[8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，小鼠Zeb-1基因的變異會(huì)導(dǎo)致腭裂發(fā)生，并且在腭胚突的間充質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)了E-cadherin的異位表達(dá)以及間充質(zhì)細(xì)胞增殖能力降低[9]。這提示E-cadherin的異位表達(dá)與Zeb-1變異小鼠的腭裂表型可能具有一定的相關(guān)性。本研究通過(guò) real-time RCR定量分析發(fā)現(xiàn)，雖然DEX可致胎鼠形成短小腭突，但是腭突中E-cadherin與β-catenin在腭突上皮與間充質(zhì)中的表達(dá)量比對(duì)照組明顯增多，由此推測(cè)腭裂可能的形成機(jī)制是：DEX的作用導(dǎo)致E-cadherin在腭突間充質(zhì)中異位表達(dá)，使腭突間充質(zhì)黏附性增加，不利于間充質(zhì)的增殖生長(zhǎng)，從而形成短小腭突，最終導(dǎo)致腭裂的形成。

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