儲(chǔ)眉 廖貴清 唐文 周媛 蘇宇雄 梁玉潔

1.廣州市第八人民醫(yī)院口腔科，廣州 510440；2.中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，廣州 510055；3.香港大學(xué)牙醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，香港 999077

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的頭頸部惡性腫瘤，目前治療以手術(shù)和放化療為主，但患者5年生存率無(wú)明顯提高[1]。OSCC患者存在著較嚴(yán)重的免疫缺陷，因此近年來提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的免疫治療成為研究熱點(diǎn)[2-3]。在腫瘤浸潤(rùn)的白細(xì)胞中，髓樣來源的抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是免疫抑制作用網(wǎng)絡(luò)中的重要成員[4]，構(gòu)成了有著不成熟狀態(tài)和抑制T細(xì)胞增殖作用的髓樣細(xì)胞的異質(zhì)群體。本研究建立4-硝基喹啉-1-氧化物（4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO）舌癌小鼠模型，觀察MDSC在舌癌小鼠中的表達(dá)，并探討其在口腔癌中的意義。

1 材料和方法

1.1 4NQO舌癌模型建立

36只雌性4～6周齡的C57BL/6小鼠及標(biāo)準(zhǔn)固體飼料均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在無(wú)特異病原體條件下飼養(yǎng)，室溫18～25 ℃，濕度30%～50%，24 h光暗循環(huán)條件下，標(biāo)準(zhǔn)飼料經(jīng)鈷60輻照后喂養(yǎng)。4NQO用雙蒸水配制成0.5 g·L-1母液。實(shí)驗(yàn)組24只小鼠用避光瓶喂養(yǎng)，4NQO母液用滅菌普通自來水配成50 mg·L-1工作液，每周更換4NQO水，連續(xù)飲用16周后，改為飲用普通滅菌自來水至第28周。對(duì)照組12只小鼠飲用普通滅菌自來水28周。

1.2 取材及組織病理學(xué)觀察

在第16、20、24及28周時(shí)，6只實(shí)驗(yàn)組小鼠及3只對(duì)照組小鼠予4%水合氯醛鎮(zhèn)靜后經(jīng)眼眶取外周血，處死后取全舌標(biāo)本。舌標(biāo)本一半立即冰凍固定用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real timepolymerase chain reaction，qRT-PCR）或后續(xù)免疫組織化學(xué)染色，另一半立即固定于10%中性甲醛緩沖液中，24 h后乙醇梯度脫水，石蠟包埋，4 μm切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

根據(jù)組織學(xué)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分為3組：正常對(duì)照組12只，異常增生組9只，OSCC組12只。采用葡聚糖聚合物法（labelled dextran polymer method，LDP），切片經(jīng)脫蠟、修復(fù)抗原、滅活內(nèi)源性過氧化物酶及室溫封閉后，滴加anti-Ki67單抗4 ℃孵育過夜。加入二抗室溫孵育，二氨基聯(lián)苯胺（3,3'-diaminobenzidine，DAB）染色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照省略一抗孵育步驟。光學(xué)顯微鏡400倍視野下觀察切片并計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比，每個(gè)樣本取10個(gè)視野，計(jì)算均值，表示為標(biāo)記指數(shù)（labeling indices，LI）。

1.4 流式細(xì)胞學(xué)分析

根據(jù)前述組織學(xué)結(jié)果分為3組的小鼠，再行流式細(xì)胞學(xué)分析。每只小鼠血液分為兩份樣本，分別加入30 μL血，一份用抗CD11b和粒性白細(xì)胞分化抗原-1（granulocyte-differentiation antigen-1，Gr-1）抗體，另一份用抗CD3、抗CD4和CD8抗體，進(jìn)行熒光標(biāo)記并染色。兩份標(biāo)本分別加入紅細(xì)胞裂解液100 μL，室溫裂解并PBS洗滌后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 小鼠病變組織免疫組織化學(xué)染色

優(yōu)化的切片溫度（optimal cutting temperature，OCT）包埋的組織制成4 μm冰凍切片，冰丙酮固定，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫封閉后，Gr-1單抗1︰10后的切片4 ℃孵育過夜。加入生物素化二抗室溫孵育，再加高靈敏度的鏈霉親和素（high sensitivity streptavidin，HSS）-辣根過氧化物酶室溫孵育后DAB染色，蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照省略一抗孵育步驟。光鏡下觀察切片。

1.6 qRT-PCR

分組同前述。采用Trizol法提取舌病變組織內(nèi)總RNA，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA用于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)引物如下。精氨酸酶1（arginase 1，ARG-1）上游引物序列：5'-GAAGAACCCACGGTCTGTGG-3'，下游引物序列：5'-TCCAACTGCCAGACTGTGGTC-3'； 甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5'-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3'，下游引物序列：5'-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3'。PCR反應(yīng)條件：93 ℃ 3 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。將每個(gè)樣本mRNA水平與相應(yīng)GAPDH表達(dá)水平之比得到目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平，再與正常小鼠的表達(dá)水平相比較，計(jì)算出表達(dá)倍數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。MDSC的數(shù)值是占外周血細(xì)胞的百分比，CD3+CD4+和CD3+CD8+的數(shù)值是占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比。組間差異的比較采用ANOVA分析。Spearman相關(guān)系數(shù)用于評(píng)價(jià)兩個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4NQO誘導(dǎo)小鼠舌組織癌變

在第28周觀察期結(jié)束時(shí)，每只實(shí)驗(yàn)組小鼠口腔黏膜都出現(xiàn)一個(gè)或以上病變，病變部位多位于舌背黏膜，呈現(xiàn)乳頭狀或菜花狀新生物，伴輕微糜爛現(xiàn)象。隨時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)了由正常黏膜，經(jīng)上皮單純性增生，到異常增生，最終發(fā)展成早期浸潤(rùn)癌的組織學(xué)變化過程。第16周時(shí)6只4NQO誘導(dǎo)（實(shí)驗(yàn)組）小鼠有3只（50%）出現(xiàn)異常增生，3只（50%）出現(xiàn)單純性增生；20周時(shí)6只實(shí)驗(yàn)組小鼠有4只（67%）出現(xiàn)異常增生，2只（33%）出現(xiàn)浸潤(rùn)癌；24周時(shí)6只實(shí)驗(yàn)組小鼠有2只（33%）出現(xiàn)異常增生，4只（67%）出現(xiàn)浸潤(rùn)癌；28周時(shí)6只（100%）實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)浸潤(rùn)性癌（圖1）。同時(shí)間點(diǎn)的3只對(duì)照組小鼠均未發(fā)現(xiàn)異常增生、上皮層次紊亂等變化。根據(jù)組織學(xué)結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)分為3組：異常增生組9只，OSCC組12只，正常對(duì)照組12只。

圖1 小鼠舌黏膜的染色結(jié)果 HE × 200Fig 1 Staining results in tongue mucosa of mice HE × 200

2.2 Ki67免疫組織化學(xué)染色

正常舌黏膜基底層細(xì)胞胞核呈現(xiàn)Ki67陽(yáng)性染色，LI為20.31%±2.42%；在上皮單純性增生時(shí)，Ki67表達(dá)不僅位于基底細(xì)胞層，有的甚至累及基底細(xì)胞上層，LI為25.08%±2.14%；在上皮異常增生區(qū)域，陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)一步增加，LI為31.11%±3.58%；Ki67在OSCC中呈彌散性表達(dá)，LI為46.75%±3.46%。單純?cè)錾M、異常增生組和OSCC組LI明顯高于正常組（圖2）。

圖2 小鼠舌黏膜Ki67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 LDP × 200Fig 2 Ki67 immunohistochemical staining in tongue mucosa of mice LDP × 200

2.3 MDSC細(xì)胞和T細(xì)胞亞群在外周血的變化

在腫瘤進(jìn)展過程中，從正常對(duì)照組到異常增生和OSCC組，外周血MDSC細(xì)胞持續(xù)顯著增加（P＜0.01）。OSCC組CD3+CD8+細(xì)胞百分比較正常對(duì)照組與異常增生組明顯升高（P＜0.01），但正常對(duì)照組與異常增生組間無(wú)明顯變化（P=0.062）。當(dāng)3組比較時(shí)，CD4+/CD8+比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。配對(duì)比較發(fā)現(xiàn)各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），然而，CD3+CD4+細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯增加（P=0.534）（表1、圖3）。

2.4 小鼠外周血中MDSC細(xì)胞與T細(xì)胞亞群及CD4+/CD8+比相關(guān)性分析結(jié)果

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MDSC細(xì)胞與CD3+CD8+細(xì)胞呈現(xiàn)正相關(guān)（r=0.772，P＜0.01），MDSC細(xì)胞比例與CD4+/CD8+比呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（r=-0.830，P＜0.01），但MDSC細(xì)胞與CD3+CD4+細(xì)胞無(wú)明顯相關(guān)（r=0.181，P＞0.05）。

表1 不同病理分級(jí)時(shí)小鼠外周血細(xì)胞亞群的比例Tab 1 Frequency of peripheral blood cell subsets in mice with different pathological classification

2.5 MDSC細(xì)胞在病變組織中的表達(dá)

在實(shí)驗(yàn)組小鼠的舌黏膜中，表達(dá)陽(yáng)性Gr-1的免疫細(xì)胞（MDSC細(xì)胞）的細(xì)胞膜呈棕黃色（圖4）。異常增生區(qū)域的MDSC細(xì)胞較正常對(duì)照組有所增加，在OSCC區(qū)域的腫瘤組織內(nèi)及與正常組織的交界處，均浸潤(rùn)了大量的MDSC細(xì)胞。

圖3 外周血中MDSC細(xì)胞和T細(xì)胞亞群細(xì)胞流式分析結(jié)果Fig 3 Flow cytometric analysis of MDSC and T cell subsets in peripheral blood

圖4 MDSC細(xì)胞在小鼠舌黏膜中的表達(dá) LSAB × 200 Fig 4 MDSC expression in tongue mucosa of mice LSAB × 200

2.6 口腔病變對(duì)酶類基因表達(dá)的影響

檢測(cè)了ARG-1在正常舌黏膜和4NQO誘導(dǎo)的舌黏膜病變部位的表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，ARG-1 mRNA在異常增生組織中的表達(dá)高于在正常舌黏膜中的表達(dá)，而在OSCC中的表達(dá)高于正常舌黏膜和異常增生組織中的表達(dá)（P＜0.05）。其中，OSCC小鼠舌癌部位ARG-1 mRNA表達(dá)水平較正常小鼠舌黏膜顯著升高（4.80±1.46）倍（P=0.01）。因此，ARG-1 mRNA的表達(dá)是隨著腫瘤進(jìn)展而增加。

3 討論

舌癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟復(fù)雜的過程。4NQO作用于口腔黏膜上皮，可能是通過引起DNA的損傷和誘發(fā)基因突變，誘導(dǎo)了舌癌的發(fā)生發(fā)展[5-6]。本研究組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)4NQO作用后，小鼠的舌黏膜出現(xiàn)了由正常黏膜向癌前病變和鱗癌轉(zhuǎn)變的過程。Ki67免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也同樣證實(shí)了該過程。Ki67是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白，作為增殖標(biāo)志物常用于檢測(cè)增殖細(xì)胞的表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤的惡性程度相關(guān)[7-8]。

髓細(xì)胞生成的異常是腫瘤免疫逃逸的重要原因[9]。這群細(xì)胞的增長(zhǎng)可誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞對(duì)抗原刺激的無(wú)應(yīng)答[9-10]，因此被命名為MDSC細(xì)胞。MDSC細(xì)胞在腫瘤狀態(tài)下可大量積蓄[2,11-12]。筆者發(fā)現(xiàn)4NQO誘導(dǎo)的小鼠隨病變進(jìn)展，外周血中Gr-1+CD11b+MDSC比例逐漸增加，明顯高于對(duì)照組。這說明MDSC的擴(kuò)增可能是促腫瘤發(fā)展環(huán)節(jié)中的重要一步。

CD4+和CD8+T細(xì)胞在介導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答中有重要作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨腫瘤進(jìn)展，外周血中CD3+CD8+T細(xì)胞比例逐漸升高，CD4+/CD8+比降低，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨腫瘤進(jìn)展，CD4+/CD8+比的減少可能是由于CD3+CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增所致，這也提示了荷瘤小鼠免疫功能逐漸減弱。Gannot等[15]也發(fā)現(xiàn)腫瘤負(fù)荷可影響系統(tǒng)免疫應(yīng)答。本研究還發(fā)現(xiàn)MDSC比例與CD3+CD8+T細(xì)胞比例存在正相關(guān)性，與CD4+/CD8+比顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系。這提示機(jī)體可能通過降低CD4+/CD8+比和提高M(jìn)DSC比例來影響抗腫瘤免疫應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)提示MDSC的擴(kuò)增與腫瘤進(jìn)展及機(jī)體免疫力低下有關(guān)。

MDSC在小鼠體內(nèi)的表型定義為Gr-1+CD11b+的細(xì)胞群。OSCC的臨床行為可能與腫瘤侵襲前沿浸潤(rùn)炎性細(xì)胞的類型有關(guān)。Yang等[16]對(duì)小鼠乳腺癌組織MDSC采用Gr-1抗體標(biāo)記后發(fā)現(xiàn)，在腫瘤與腺體組織的交界處即腫瘤侵襲前沿浸潤(rùn)了大量的MDSC。本研究免疫組織化學(xué)也發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中散在分布的MDSC在侵襲前沿表達(dá)較豐富，而在正常舌和異常增生舌黏膜區(qū)域表達(dá)較少。異常增生小鼠的外周血中MDSC較正常小鼠顯著增高，然而在舌病變部位異常增生區(qū)域表達(dá)較少，可能由于異常增生區(qū)域誘導(dǎo)分泌的細(xì)胞因子和趨化因子較少，造成了MDSC在局部微環(huán)境中的變化與循環(huán)中的變化的差別。

ARG-1可能參與MDSC誘導(dǎo)的免疫抑制作用[9,17]。本研究發(fā)現(xiàn)隨舌癌進(jìn)展，ARG-1 mRNA水平逐漸升高。這提示ARG-1基因水平的上調(diào)可能參與了口腔癌MDSC的擴(kuò)增。在腫瘤微環(huán)境中，MDSC中ARG-1的過表達(dá)，消耗了局部微環(huán)境中L-精氨酸的水平，導(dǎo)致T細(xì)胞受體信號(hào)通路的失調(diào)，使CD8+T細(xì)胞無(wú)應(yīng)答[18]。這提示MDSC浸潤(rùn)至腫瘤組織，創(chuàng)造了一個(gè)有利于腫瘤進(jìn)展的微環(huán)境，并且可能通過ARG-1發(fā)揮免疫抑制作用。

綜上所述，本研究顯示荷瘤小鼠的舌黏膜出現(xiàn)OSCC時(shí)，舌和外周血的MDSC水平顯著升高，并與病變部位ARG-1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。這提示MDSC的擴(kuò)增有可能是腫瘤進(jìn)展的重要原因，ARG-1基因水平的上調(diào)可能參與了這一過程。MDSC可能是口腔癌免疫治療的新靶點(diǎn)。

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