張微，姚笛，侯婷婷，郭瑜，佐兆杭，劉鑫

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319）

0 引言

腸出血性大腸桿菌是能引起人的出血性腹瀉和腸炎的一群大腸埃希氏菌[1、2]。以 O157：H7 血清型為代表菌株。自美國首次分離出該菌以后[3]，O157：H7的爆發(fā)和流行相繼出現(xiàn)在20多個(gè)國家。我國近幾年也通過食品安全監(jiān)測(cè)，先后從牛、羊、豬等肉類食品和乳中檢測(cè)到大腸桿菌O157：H7[5-7]。

目前，大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)方法主要是細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)法，該方法存在耗時(shí)，過程復(fù)雜，靈敏性不強(qiáng)等缺點(diǎn)。分子生物學(xué)檢測(cè)方法中應(yīng)用較廣泛的常規(guī)PCR技術(shù)也存在假陽性和不能定量等缺點(diǎn)。因此，本研究擬建立一種大腸桿菌O157：H7的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該技術(shù)具有更強(qiáng)的特異性和靈敏性，并能進(jìn)行定量。建立的方法能夠使乳中大腸桿菌的檢測(cè)更為快速和準(zhǔn)確，并為其他致病菌的快速檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌O157：H7標(biāo)準(zhǔn)菌株、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、大腸桿菌DH5α均為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

LB培養(yǎng)基，細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，質(zhì)粒抽提試劑盒，膠回收試劑盒，TaKaRa ExTaqTM（5 U/μL），rTaq（5 U/μL），MgCl2（25 mmol/L），dNTPs（10 mmol/L），DL2000DNAMarker，6×Loading Buffer，10×Loading Buffer，SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）等。

1.1.3 儀器

PCR 基因擴(kuò)增儀（9700型），電泳儀（JY04S-3B），凝膠成像系統(tǒng)（YJ600+型），Real-Time PCR儀（Line-Gene K型），臺(tái)式離心機(jī)（TGL-16B）。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與DNA模板的制備

將大腸桿菌O157：H7接種于固體LB培養(yǎng)基中，37℃，24 h，挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)過夜。取培養(yǎng)液1.0 mL，置于1.5 mL的離心管中，12 000 r/min離心2 min，滅菌ddH2O洗劑兩次，最后300 μL ddH2O懸浮，隔水煮沸15 min，8 000 r/min離心15 min，取上清，即為DNA模板。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genebank發(fā)表的大腸桿菌O157：H7的特異性基因rfbE的序列，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，上游引物：5'-CATCTTTACTTTCCTTGTGGACTTG-3'；下游引物：5'-AAACTATTACTACAGGTGAAGGTGG-3'。擴(kuò)增片段大小為261 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增和純化

以大腸桿菌O157：H7 DNA為模板，對(duì)大腸桿菌O157：H7的rfbE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)擴(kuò)增目的片段進(jìn)行回收純化，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.4 目的基因的克隆

取純化的PCR產(chǎn)物4 μL，pMD 18T載體1 μL，SolutionⅠ5 μL，輕輕混勻，16 ℃連接2 h，將連接產(chǎn)物加入100 μL E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，取適量均勻涂布于Amp+的LB平板中，37℃培養(yǎng)過夜，挑取平板中的單個(gè)菌落，接種在Amp+的LB液體培養(yǎng)液中，37℃ 180 r/min振搖過夜。按照說明書操作提取質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，將陽性克隆送上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 熒光定量PCR擴(kuò)增

測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度C值，并計(jì)算出原始拷貝數(shù)，進(jìn)行倍比稀釋后，取稀釋度不同的質(zhì)粒模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Tap（2×）（Tli RNaseH Plus）12.5 μL，上、下游引物（濃度10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為94℃（30 s），95 ℃（5 s）變性，60℃（20 s）退火、延伸，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算機(jī)自動(dòng)計(jì)算，形成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 靈敏性檢測(cè)

用ddH2O對(duì)已知濃度的大腸桿菌O157：H7的DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取質(zhì)量濃度為1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7ng/μL 的 DNA樣品2 μL進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測(cè)定其最低檢測(cè)值。

1.2.7 特異性檢測(cè)

利用建立的定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)大腸桿菌O157：H7、沙門氏菌、志賀氏菌、蠟樣芽孢桿菌4種感染人類的食品病原細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定大腸桿菌O157：H7熒光定量PCR方法的特異性。

1.2.8 模擬標(biāo)本的檢測(cè)

將大腸桿菌O157：H7制備一定濃度的菌懸液，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，測(cè)定菌落總數(shù)，將含量分別為67.0，6.70×102，6.70×103，6.70×104mL-1的大腸桿菌O157：H7摻入滅菌的牛乳中，混勻后提取DNA模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

以提取的大腸桿菌O157：H7的DNA為模板，用特異性引物PCR擴(kuò)增rfbE基因片段，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，擴(kuò)增條帶的大小與預(yù)期一致，且條帶單一，無引物二聚體。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化，然后提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，其鑒定結(jié)果如圖1所示。將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果可知擴(kuò)增產(chǎn)物與大腸桿菌O157：H7 rfbE基因的同源性為100%。

圖1 rfbE基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果

將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，取濃度依次為1×105，1×106，1×107，1×108，1×109μL-1，分別以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)模板的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。根據(jù)質(zhì)粒模板的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖3所示，得到線性方程為y=-3.40x+40.46，相關(guān)系數(shù)為0.991，表明在模板稀釋范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系。然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)模板熒光定量PCR的熔解曲線分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度均為79.5℃，說明引物的特異性很好。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)模板的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖3 標(biāo)準(zhǔn)模板的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 標(biāo)準(zhǔn)模板的熔解曲線

2.3 熒光定量PCR的特異性實(shí)驗(yàn)

利用建立的熒光定量PCR方法對(duì)大腸桿菌O157：H7、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、宋氏志賀氏菌同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果見圖5，結(jié)果表明：大腸桿菌O157：H7出現(xiàn)良好的擴(kuò)增曲線，結(jié)果為陽性，而其他細(xì)菌均未出現(xiàn)曲線擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。說明本研究建立的方法對(duì)大腸桿菌O157：H7有很好的特異性，與其他三種細(xì)菌無交叉反應(yīng)。

圖5 大腸桿菌O157∶H7熒光定量的特異性檢測(cè)

2.4 熒光定量PCR的靈敏性實(shí)驗(yàn)

將大腸桿菌O157：H7的DNA模板用dd H2O 10倍梯度稀釋成1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7ng/μL的質(zhì)量濃度，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示其靈敏度為1×10-6ng/μL。當(dāng)DNA的質(zhì)量濃度只有1×10-6ng/μL時(shí)，根據(jù)公式計(jì)算出拷貝數(shù)為3.49×103μL-1，說明建立的熒光定量PCR方法擴(kuò)增大腸桿菌O157：H7的靈敏度好。

2.5 模擬標(biāo)本的檢測(cè)

將大腸桿菌O157：H7摻入到滅菌的牛乳中，使乳中菌的含量為 67.0，6.70× 102，6.70× 103，6.70× 104mL-1，采用熒光定量PCR方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出：當(dāng)乳中大腸桿菌O157：H7的含量只有67.0 mL-1時(shí)，依然可以檢測(cè)到特異性擴(kuò)增。

圖6 模擬標(biāo)本的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

3 結(jié)論

乳制品被普遍認(rèn)為是致病性大腸桿菌的污染源[8]，檢測(cè)方法包括細(xì)菌的分離鑒定和生化鑒定等方法。本研究以致病性強(qiáng)的大腸桿菌O157：H7為檢測(cè)對(duì)象，建立熒光定量PCR檢測(cè)方法，該技術(shù)操作過程簡(jiǎn)單、快速，全部操作過程僅需3 h左右，大大提高了工作效率，與其他方法相比靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)的靈敏度可達(dá)1×10-6ng/μL，拷貝數(shù)為3.49×103μL-1，且與蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌三種細(xì)菌均無交叉反應(yīng)。利用建立的方法檢測(cè)人工污染乳中的大腸桿菌 O157：H7，發(fā)現(xiàn)乳中大腸桿菌O157：H7的含量只有67.0 mL-1時(shí)，依然可以檢測(cè)到特異性擴(kuò)增，說明該方法的靈敏度很高。本研究為建立乳中大腸桿菌O157：H7的檢測(cè)體系提供了一種高效、便捷、可靠的新技術(shù)，同時(shí)也為乳制品中其他致病菌的檢測(cè)提供了參考，具有較高的推廣和使用價(jià)值。

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