張冬蕾，任艷，德亮亮，陳紅霞，楊彥榮，劉文俊，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引言

羊奶營養(yǎng)成分最接近母乳，被稱為“奶中之王”[1]。而酸羊奶營養(yǎng)價值更是優(yōu)于鮮羊奶[2]。

乳酸菌是一群形態(tài)、代謝和生理特征不完全相同的革蘭氏陽性菌。國內(nèi)外關(guān)于羊奶制品中乳酸菌分離鑒定的報導(dǎo)很多。張文羿等[3]從青海海西州11份酸山羊奶中分離得到33株乳酸菌，Streptococcus thermophilus為優(yōu)勢菌群。Medina等[4]對阿根廷西北部綿羊奶中的乳酸菌分離鑒定結(jié)果表明Enterococcus為優(yōu)勢菌群。A Yelnetty等[5]對印度尼西亞酸山羊奶中的乳酸菌分離鑒定結(jié)果表明，桿菌數(shù)量顯著多于球菌數(shù)量。

本研究采用純培養(yǎng)技術(shù)對內(nèi)蒙古鄂爾多斯羊鮮乳與酸乳中的乳酸菌分離、鑒定，以及16S rRNA序列分析，并分析其優(yōu)勢菌群，以獲得鄂爾多斯羊奶制品中乳酸菌的基本信息，為羊奶中乳酸菌資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料

本研究中21份羊鮮乳與酸乳樣品（4份鮮綿羊奶，10份酸綿羊奶，以及7份酸山羊奶，均為鄂爾多斯地區(qū)當(dāng)?shù)赝练N羊）采集信息如表1所示，由實驗室的研究人員于2014年7月14日-2014年7月17日在內(nèi)蒙古鄂爾多斯市的不同地區(qū)采集（其中，羊酸乳為自然發(fā)酵乳，采集條件：溫度為18～23℃，pH值在4.5以下,1～2 d發(fā)酵）。樣品采集后低溫保存，帶回實驗室于-80℃超低溫保藏，進行后續(xù)實驗。

1.1.2 常用培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基（CM0359），MRS固體培養(yǎng)基（288210），M17液體培養(yǎng)基（CM0817B），M17固體培養(yǎng)基（CM0785B）。

表1 內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)羊乳制品種類及來源

試劑：提取DNA、PCR擴增以及電泳檢測所用到的緩沖液和常用試劑根據(jù)參考文獻[6]。

1.1.3 儀器設(shè)備

HWS28型電熱恒溫水浴鍋，AR2202CN型電子天平，KDC-1044型低速離心機，LRH-250生化培養(yǎng)箱，ZHJH-C1214C型超凈工作臺，BX50型光學(xué)顯微鏡，HA-300M型全自動高壓蒸汽滅菌器，SP-650型全自動高壓干熱滅菌器，WD-9405B型水平搖床，LL-6SFPY型真空冷凍干燥機，DYY-12型電泳儀，GDS-8000型凝膠成像儀，ND-1000型微量紫外分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

采集乳樣時，先將其混勻，再移取1.5 mL至裝有滅菌中和劑（內(nèi)含0.5 g， ∶m淀粉=1∶50，質(zhì)量比）的2.5 mL無菌螺口凍存管中，混勻并用封口膜封口后標號。最后將采集的乳樣置于4℃便攜式冰箱中以維持其低溫狀態(tài)，帶回實驗室盡快進行乳酸菌的分離鑒定。

1.2.2 乳酸菌的活菌計數(shù)

乳酸菌的活菌計數(shù)根據(jù)文獻[7]中采用傾注法進行。30℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h進行乳酸菌的活菌計數(shù)。

1.2.3 乳酸菌的分離

純化及保存：羊乳制品中乳酸菌的分離及保存根據(jù)文獻[8]中方法進行，簡單概括為，將樣品梯度稀釋后，涂布于MRS和M17兩種培養(yǎng)基上隨機選擇不同菌落形態(tài)的單菌落進行乳酸菌的初步判定，然后進行進一步驗證和鑒定。

1.2.4 乳酸菌基因組DNA的提取以及純度檢測

采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[9]。再用ND-1000型微量紫外分光光度計測其濃度以及OD260/280值。根據(jù)所測得的DNA原液質(zhì)量濃度將其稀釋至最終質(zhì)量濃度為100 ng/μL，稀釋液置于4℃冰箱中備用。

1.2.5 乳酸菌16S rRNA基因的PCR擴增

將1.2.4中的DNA稀釋液作為PCR擴增的模板采用50 μL體系進行擴增。以細菌16S rRNA基因通用引物[10]進行16S rRNA基因的PCR擴增。

16S rRNA基因的PCR擴增引物序列如下：

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'

擴增體系：5 μL10× EasyTaq Buffer（+Mg2+）；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物 FA-27F（10 mmol/L）；1.5 μL引 物 RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA模板（100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。16S rRNA基因的PCR擴增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃末端延伸10 min。

擴增后，取約2 μL的PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在1 500 bp處有清晰的擴增條帶且無拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR擴增成功。

1.2.6 乳酸菌16S rDNA序列測定

乳酸菌16S rDNA序列測定由上海美吉生物技術(shù)有限公司完成。運用SeqMan（DNAStar 5.01）軟件進行序列拼接后，再利用NCBI中的BLAST將拼接好的序列與數(shù)據(jù)庫中已鑒定的乳酸菌16S rDNA序列進行同源性比對，以同源性大于99%為種的分界閾值將待測菌株鑒定到種或亞種。運用MEGA 4.0軟件進行乳酸菌模式株和分離株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)羊乳制品中乳酸菌計數(shù)結(jié)果

內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)羊乳制品中乳酸菌活菌數(shù)見表2。從中可以看出內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)采集的羊乳制品中，鮮奶樣品活菌數(shù)在5.03～5.88 mL-1（對數(shù)值，下同）之間，酸奶樣品活菌數(shù)在7.78～9.84 mL-1之間。其中，4份樣品活菌數(shù)大于109mL-1，9份樣品活菌數(shù)大于108mL-1，4份樣品活菌數(shù)大于107mL-1，4份樣品活菌數(shù)小于106mL-1。由乳酸菌活菌計數(shù)結(jié)果可知，所有酸奶樣品活菌數(shù)均大于107mL-1，可見內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)的酸羊乳制品新鮮度較高，菌株存活能力強，有利于下一步的分離鑒定。而鮮奶樣品活菌數(shù)均小于106mL-1，符合國家標準生鮮乳收購標準，說明內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)的鮮綿羊奶樣品新鮮度高。

乳酸菌活菌數(shù)顯示了樣品的新鮮度以及在運輸、貯藏過程中菌株的存活狀況。樣品編號為YM39～YM41，YM44～YM46，YM48的樣品為酸山羊奶，其活菌數(shù)對數(shù)值在7.83～9.41 mL-1之間。張文羿等[11]對11份青海海西州酸山羊奶中的乳酸菌進行了計數(shù)，結(jié)果為8.40～9.48 mL-1（對數(shù)值）之間。包秋華等[12]對13份云南酸山羊奶的研究表明，其乳酸菌活菌數(shù)為8.32～10.34 mL-1（對數(shù)值）之間。由此可見，本研究的7份酸山羊奶中乳酸菌的計數(shù)結(jié)果與青海以及云南酸山羊奶中乳酸菌活菌數(shù)基本一致。

表2 內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)羊乳制品中乳酸菌活菌計數(shù)結(jié)果

盡管上述研究對我國山羊乳中乳酸菌數(shù)量進行了研究，但對同一地區(qū)中不同羊種的發(fā)酵乳中乳酸菌研究較少，特別是對同一羊種鮮乳和自然發(fā)酵乳中乳酸菌的數(shù)量研究更少，本研究不僅對鄂爾多斯地區(qū)綿羊乳和山羊乳中乳酸菌數(shù)量進行了分析，還對鮮綿羊乳和自然發(fā)酵綿羊乳中乳酸菌數(shù)量進行了分析（圖1）。由圖1可以看出，酸奶樣品的活菌數(shù)高于鮮奶樣品的活菌數(shù)。

圖1 不同樣品中乳酸菌活菌計數(shù)結(jié)果

圖1中，差異顯著性分析顯示鮮綿羊奶、酸綿羊奶、酸山羊奶間乳酸菌活菌計數(shù)結(jié)果差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 乳酸菌分離株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及16S rDNA序列鑒定結(jié)果

為了將待測菌株鑒定到種，登陸NCBI中的Blast分析所有待測菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列。再將拼接好的序列上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫中。利用MEGA 4.0軟件[13]進行乳酸菌模式株和分離株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。

選取部分具有代表性的菌株用Mega 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。

圖2 部分分離株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出，菌株IMAU11214（KP716575）、IMAU11217（KP716576）與標準菌株Enterococcus durans ATCC19432聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為 Enterococcus durans。菌株IMAU11334（KP716580）、IMAU11335（KP716581）與標準菌株Enterococcus faecalis JCM5803聚為一類，且同源性為100%，因此可將其鑒定為Enterococcusfaecalis。菌株IMAU11225（KP716584）、IMAU11227（KP716585）與標準菌株 Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC 19435聚為一類，且同源性為99%，故將其歸為Lactococcus lactis subsp.lactis。菌株IMAU11298（KP716597）、IMAU11306（KP716631）與標準菌株Lactobacillus plantarum ATCC 14917聚為一類，且同源性高達100%，因此可將其歸為Lactobacillus plantarum。菌株IMAU11215（KP716598）、IMAU11216（KP716599）與標準菌株Lactobacillus helveticus DSM 20075聚為一類，且同源性高達100%，故將其鑒定為Lactobacillus helveticus。菌株IMAU11275（KP716595）、IMAU11292（KP716596）與標準菌株Leuconostoc pseudomesenteroides NRIC 1777聚為一類，且同源性達到99%，因此鑒定為Leuconostoc pseudomesenteroides。菌株IMAU11230（KP716569）、IMAU11359（KP716573）與標準菌株Leuconostoc mesenteroides NCFB 529聚為一類，且同源性高達100%，故將其歸為Leuconostoc mesenteroides。根據(jù)16S rRNA基因序列分析，21份羊乳制品中共分離得到68株乳酸菌，其中，乳桿菌36株（占總分離株的52.94%），乳球菌32株（占總分離株的47.06%）。這些菌株歸為4個屬，7個種或亞種。

5個乳球菌屬種為：Enterococcus durans，Enterococcus faecalis，Lactococcus lactis subsp.lactis，Leuconostoc mesenteroides，Leuconostoc pseudomesenteroides。

2個乳桿菌屬種為：Lactobacillus helveticus，Lactobacillus plantarum。

2.3 羊乳制品中優(yōu)勢菌種分析

本研究中，21份羊乳制品共分離出68株乳酸菌，分別為7個種及亞種。內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)21份羊乳制品樣品的菌株分離鑒定結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，21份樣品中有14份樣品能夠分離得到Lactobacillus helveticus，且共分離得到31株，占總分離株的45.59%，說明Lactococcus lactis subsp.lactis為鄂爾多斯地區(qū)羊乳制品中乳酸菌的優(yōu)勢種。6份樣品中能夠分離得到Lactococcus lactis subsp.lactis（17.65%），5份樣品中能夠分離得到Leuconostoc mesenteroides（11.76%），其他菌種，包括：Enterococcus durans，Enterococcusfaecalis，Leuconostocpseudomesenteroides，Lactobacillus plantarum在樣品中分離數(shù)量相對較少。

表3 內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)羊鮮乳與酸乳樣品的菌株分離鑒定結(jié)果

4份鮮奶樣品中有3份樣品能夠分離得到球菌，只有1份樣品能夠分離得到桿菌，而17份酸奶樣品中有15份樣品能夠分離得到桿菌，只有6份樣品能夠分離得到球菌，說明鮮奶樣品中球菌數(shù)量較多，而酸奶樣品中桿菌數(shù)量較多。這是因為桿菌與球菌的細胞壁或細胞膜對酶活性的保護作用不同，導(dǎo)致桿菌耐酸，適合在酸奶中生長，而球菌不耐酸，在鮮奶中數(shù)量較多。Acurcio L B等[14]分析了20份綿羊鮮奶中的微生物組成，發(fā)現(xiàn)Enterococcus為其優(yōu)勢菌群。

特別是樣品YM14中共分離得到8株乳酸菌，其中5株為Lactococcus lactis subsp.lactis，說明Lactococcus lactis subsp.lactis為樣品YM14中的優(yōu)勢菌。樣品YM22、YM41中共分離得到5株乳酸菌，其中4株為Lactobacillus helveticus，說明 Lactobacillus helveticus為樣品 YM22、YM41中的優(yōu)勢菌。

不同羊乳制品中乳酸菌的分離株數(shù)量可比較內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)不同羊乳制品中乳酸菌的優(yōu)勢菌種，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，本研究的內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)綿羊鮮奶中，Lactococcus lactis subsp.lactis為優(yōu)勢菌種，占綿羊鮮奶總分離株的38.46%。而酸羊乳制品中的總體優(yōu)勢菌種為Lactobacillus helveticus，占總分離株的45.59%。其中，酸綿羊奶L.helveticus占總分離株的51.43；酸山羊奶L.helveticus占總分離株的60%。這與劉紅霞等[15]對蒙古戈壁地區(qū)3份酸山羊奶的分離結(jié)果，以及董曉婉等[16]對新疆地區(qū)25份酸奶的分離結(jié)果相似。

圖3 不同羊乳制品中乳酸菌分離株的相對數(shù)量比較分析

3 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對采集自鄂爾多斯地區(qū)的21份羊鮮乳和酸乳制品中的乳酸菌進行分離和鑒定，21份乳制品中共分離68株乳酸菌。通過16S rRNA基因同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，將68株乳酸菌鑒定為4個屬，7個種及亞種。其中，L.lactis subsp.lactis為綿羊鮮奶的優(yōu)勢菌種，L.helveticus為鄂爾多斯地區(qū)羊酸乳制品中乳酸菌的優(yōu)勢種，分別占總分離株的38.46%和45.59%。乳酸菌活菌計數(shù)結(jié)果表明，鄂爾多斯地區(qū)采集的羊乳制品中，鮮奶樣品活菌數(shù)在5.03～5.88 mL-1（對數(shù)值）之間，酸奶樣品活菌數(shù)在7.78～9.84 mL-1（對數(shù)值）之間，且不同羊乳制品中乳酸菌活菌數(shù)不同，其中酸奶樣品的活菌數(shù)高于鮮奶樣品的活菌數(shù)，表明內(nèi)蒙古鄂爾多斯地區(qū)鮮羊乳與酸羊乳優(yōu)勢菌群顯著不同。

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