黃寶瑩，佘之蘊，劉海卿，林耀文，羅湘蓉，黃玲玲

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東順德528000）

0 引言

乳酸菌是一類能在可利用的碳水化合物發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量乳酸的細菌，被廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵制品和生物制品領(lǐng)域。乳酸菌因具有健胃整腸[1]、抗腫瘤[2]、降低膽固醇、減少過敏反應(yīng)[3]、抗氧化活性[4]等多種保健功能而備受消費者喜愛。按照《GB 4789.35-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗乳酸菌檢驗》（GB法）[5]要求，乳酸菌數(shù)不得低于106mL-1。本文主要研究三種因素對GB法中的乳酸菌總數(shù)檢測方法的影響，評價不同培養(yǎng)基、含氧量和接種方法檢測結(jié)果的一致性、等價性或可交換性，以期為日常檢測和科研工作提供參考。

1 實驗

1.1 培養(yǎng)基

MRS瓊脂，TPY瓊脂，BBL瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

CL-40M高壓滅菌鍋；GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃熱珠滅菌器；Easymix拍擊式均質(zhì)器；dilumat S電子稀釋器；AnaeroPack厭氧培養(yǎng)罐。

2 方法

2.1 乳酸菌總數(shù)檢測

參照GB 4789.35-2010（GB法）對乳酸菌總數(shù)進行測定。對發(fā)酵乳樣進行10倍系列稀釋，選擇適宜的2-3個梯度，每個稀釋度吸取0.1 mL樣品勻液分別置于2個MRS瓊脂平板上進行涂布，并于（36±1）℃，厭氧培養(yǎng)48 h±2 h后計數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。

2.2 不同培養(yǎng)基對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

對同一個發(fā)酵乳樣品，分別用MRS、TPY和BBL培養(yǎng)基檢測乳酸菌總數(shù)，重復(fù)十次，操作步驟按2.1進行，運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異[6-7]。

2.3 不同含氧量對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

對同一個發(fā)酵乳樣品，按2.1測定乳酸菌總數(shù)，培養(yǎng)條件分別為厭氧（氧氣質(zhì)量分數(shù)為0%）、微需氧（氧氣質(zhì)量分數(shù)為8%～9%，二氧化碳質(zhì)量分數(shù)為7%～8%）和需氧，重復(fù)10次，運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異。

2.4 不同接種方法對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

對同一個發(fā)酵乳樣品，按2.1測定乳酸菌總數(shù)，接種方法分別為傾注法和涂布法，涂布法取樣量為0.1 mL，傾注法取樣量為1 mL。運用SPSS軟件采用配對t檢驗對比分析，比較其均值是否存在差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

分別用MRS，BBL和TPY培養(yǎng)基檢測乳酸菌總數(shù)，結(jié)果如表1所示。表1除傾注法是計數(shù)10-6稀釋度結(jié)果，其他均為10-5稀釋度結(jié)果。為方便計算和分析，直接對計數(shù)結(jié)果進行配對t檢驗，各乳酸菌檢測結(jié)果均為2次平行實驗結(jié)果的平均值。表1中GB法即為MRS、厭氧和涂布的結(jié)果。MRS培養(yǎng)基的檢測結(jié)果分別與BBL和TPY是配對的兩組數(shù)據(jù)，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設(shè)臨界水平α=0.05，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表2和表3所示。

表1 各因素對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

表2 培養(yǎng)基因素基本描述統(tǒng)計量

表3 培養(yǎng)基因素t檢驗結(jié)果

由表2可以看出，MRS，BBL和TPY培養(yǎng)基檢測結(jié)果的均值分別為202.70，222.20和181.40；標(biāo)準(zhǔn)差分別是19.49957，23.73371和22.90657。標(biāo)準(zhǔn)差MRS＜TPY＜BBL。說明MRS培養(yǎng)基的結(jié)果波動性相對小，精密度、再現(xiàn)性較好，有利結(jié)果的復(fù)現(xiàn)以及適用于實驗室之間比對。

表5 含氧量t檢驗結(jié)果

由表3可以看出，MRS與BBL均值之間的差值為-19.50，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為29.38348，t值為-2.099，顯著性P為0.065＞0.05，說明MRS與BBL的檢測結(jié)果之間的差異不顯著。MRS與TPY均值之間的差值為21.30，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為37.10960，t值為1.815，自由度為9，顯著性P為0.103＞0.05，說明MRS與TPY的檢測結(jié)果之間沒有顯著性差異。

3.2 不同含氧量對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

分別在厭氧、微需氧和需氧條件下培養(yǎng)乳酸菌（如表1）。厭氧的檢測結(jié)果分別與微需氧、需氧是配對的兩組數(shù)據(jù)，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設(shè)臨界水平α=0.05，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表4和表5所示。

表4 含氧量基本描述統(tǒng)計量

由表4可以看出，厭氧、微需氧和需氧的檢測結(jié)果的均值分別為202.70、70.70和4.90；標(biāo)準(zhǔn)差分別是19.49957、19.81049和2.37814。從均值就可以直接看出含氧量對檢測結(jié)果影響非常大。檢測樣品中含有乳雙歧桿菌（Bifidobacterium lactis）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus.bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium infantis）四種菌株。各種乳酸菌或益生菌因普遍缺乏好氧的呼吸鏈（或電子傳遞鏈）酶系，以發(fā)酵方式獲取能量，故在與游離氧的關(guān)系上，大多數(shù)是一些耐氧性厭氧菌、微好氧菌、兼性厭氧菌或?qū)Ｐ詤捬蹙６鄶?shù)耐氧性厭氧菌中存在SOD和過氧化氫酶，可使高毒性的O2-變成毒性稍低的H2O2，進一步還原成無毒的H2O。一些嚴格的厭氧菌既無SOD又缺乏過氧化氫酶或過氧化物酶，故細胞在有氧環(huán)境下形成的O2-極易殺死自己，這就是厭氧菌對氧的高度敏感性或氧對它們毒害的主要原因[8]。

由表5可以看出，厭氧與微需氧均值之間的差值為132.00，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為28.11880，t值為14.845，顯著性P為0.000＜0.01，說明厭氧與微需氧的檢測結(jié)果之間的差異非常顯著。厭氧與需氧均值之間的差值為197.80，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為19.24578，t值為32.501，顯著性P為0.000＜0.01，說明厭氧和需氧的檢測結(jié)果之間也是存在非常顯著的差異。

3.3 不同接種方法對乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果的影響

分別采用傾注法和涂布法進行接種，結(jié)果如表1所示。涂布法檢測結(jié)果與傾注法是配對的兩組數(shù)據(jù)，運用SPSS軟件按照配對t檢驗進行分析，設(shè)臨界水平α=0.05，數(shù)據(jù)分析結(jié)果如表6和表7所示。

表6 接種方法基本描述統(tǒng)計量

表7 接種方法t檢驗結(jié)果

表6結(jié)果顯示，涂布法和傾注法所得結(jié)果的均值分別為202.70和198.30；標(biāo)準(zhǔn)差分別是19.49957和16.09037。傾注法標(biāo)準(zhǔn)差小于涂布法。說明傾注法的結(jié)果波動性相對小。

由表7可以看出，涂布和傾注均值之間的差值為4.40，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為21.10398，t值為0.659，顯著性P為0.526＞0.05，說明涂布和傾注的檢測結(jié)果之間的差異不顯著。傾注和涂布方法得到的乳酸菌總數(shù)基本一致，只是傾注法乳酸菌的菌落較小，較難觀察，而涂布法得到的菌落分布均勻，直徑較大，便于計數(shù)。

4 結(jié)束語

（1）研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用MRS，BBL，TPY培養(yǎng)基檢測乳酸菌總數(shù)所得結(jié)果在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異，檢測結(jié)果具有一致性。乳酸菌在MRS，BBL，TPY培養(yǎng)基上菌落形態(tài)也十分相似：乳黃色，直徑1～2 mm，圓形。這是由其營養(yǎng)、代謝等生理特性決定的。

（2）微需氧和需氧培養(yǎng)條件的乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果，與厭氧相比，都存在非常顯著的差異，說明含氧量對乳酸菌的生長繁殖產(chǎn)生很大的影響。不同品牌的酸奶本身含有的菌種類型不同，因而含氧量對不同樣品的乳酸菌總數(shù)影響很大。

（3）涂布法和傾注法所得檢測結(jié)果并無顯著性差異。兩種接種方法各有優(yōu)缺點。涂布法的優(yōu)點是菌落生長在表面，形態(tài)均勻，便于計數(shù)；缺點是取樣量?。?.1 mL）使得結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差較大，平板不干燥或涂布不均勻反而影響計數(shù)，操作步驟也較為繁瑣。傾注法的優(yōu)點是取樣量大（1 mL）使得結(jié)果波動性較小，操作簡單；缺點是乳酸菌在培養(yǎng)基內(nèi)部生長時菌落較小，不利于觀察菌落形態(tài)和計數(shù)。綜上所述，在檢測過程中，兩種接種方法具有可交換性。

[1]王曦,許曉燕,余夢瑤,等.乳酸菌的保健功能及其作用機制研究進展[J].中國乳品工業(yè),2010（9）：38-41.

[2]OHASHI Y,NAKAI S,TSUKAMOTO T,et al.Habitual Intake of Lactic Acid Bacteria and Risk Reduction of Bladder Cancer[J].Urol Int,2002,68（4）：273-280.

[3]NORY K,CHAMBERS S J,PN C,et al O ral delivery of Lacbbacillus casei Shirota modifies allergen-induced immune responses in allergic rhinitis[J].Clin Exp Allergy,2008,38（8）：1282-1289.

[4]VERENA J K,BRIGITTE MARIAN,REINHARD STIDL,et al.Impact of Lactic Acid Bacteria on Oxidative DNA Damage in Human Derived Colon Cells[J].Food and Chemical Toxicology,2008,46：1221-1229.

[5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 19302—2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[6]張文彤.SPSS11統(tǒng)計分析教程（基礎(chǔ)篇）[M].北京：北京希望電子出版社,2002：223-229.

[7]劉慶武,張小清,羅玉玲,等.如何用SPSS、SAS進行t檢驗的運算[J].湘南學(xué)院學(xué)報,2004,04：49-51.

[8]熊德鑫,劉秉陽.氧氣對厭氧菌的毒性作用機理[J].國外醫(yī)學(xué)：微生物學(xué)分冊,1983,01：6-8.