陳永福，李常坤，王記成

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特 010018）

0 引言

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin-I-convertingen enzyme，ACE，EC 3.4.15.1）是普遍存在于哺乳動物組織中的一種膜結(jié)合的二肽羧基酶，ACE通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)、激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)，對人體的血壓、電解質(zhì)和體液平衡、心血管系統(tǒng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)重塑等具有重要作用，因此ACE已成為現(xiàn)代醫(yī)學治療高血壓最有效的靶點之一[1-3]。

L.helveticus H9分離自然發(fā)酵牦牛乳樣品，是目前國內(nèi)抗高血壓領(lǐng)域研究最為系統(tǒng)的益生乳酸菌，該菌株來源明確，遺傳背景清楚，其應(yīng)用前景良好[4,5]。

本文考察了L.helveticus H9和17株生產(chǎn)特性優(yōu)良的菌株及商業(yè)發(fā)酵劑組合復(fù)配發(fā)酵乳的ACE抑制率、Val-Pro-Pro（VPP）濃度、Ile-Pro-Pro（IPP）濃度和發(fā)酵特性，并對不同組合發(fā)酵乳的ACE抑制活性與發(fā)酵特性進行相關(guān)性分析，以期為該菌株發(fā)酵乳和相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株來源

L.helveticus H9和復(fù)配發(fā)酵菌種均保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學乳酸菌菌種資源庫（Lactic acid bacteria collec-tion center，LABCC），其中商業(yè)酸乳發(fā)酵劑YC-X11由科·漢森（中國）有限公司以直投式發(fā)酵劑形式提供，相關(guān)信息如表1所示。

1.2 主要試劑及設(shè)備

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、馬尿酸（HA）、甲醇、乙腈、三氟乙酸等色譜純試劑；Ile-Pro-Pro（IPP，純度＞99.5%）和Val-Pro-Pro（VPP，純度＞99.5%）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；MRS培養(yǎng)基（Man Rogosa Sharpe broth）、脫脂乳培養(yǎng)基等的配制參照文獻[6-9]進行。

UV-1700型紫外分光光度計，5810R型臺式高速冷凍離心機，Agilent1100液相色譜系統(tǒng)，UPLC/Q-Tof液質(zhì)聯(lián)用儀。

1.3 方法

1.3.1 菌種及發(fā)酵乳的制備

供試菌種準備：將表1所列的L.helveticus H9和其他菌種接入到11%滅菌脫脂乳（121℃，7 min滅菌，急冷，蛋白質(zhì)量分數(shù)3.6%）中活化，再按1%接種量在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，并轉(zhuǎn)接兩次，以便菌株活力得到充分恢復(fù)并用平板法計數(shù)，使菌體在含1%胰蛋白胨的PBS（濃度0.01 mol/L，pH值7.2，濃度為0.15 mol/L的NaCl）中4℃冰箱保存，用于發(fā)酵乳的制備。

發(fā)酵乳制備：將L.helveticus H9和所需復(fù)配菌種都按5×106mL-1（L.helveticus H9∶復(fù)配菌種=1∶1）接入11%的脫脂乳中，37℃發(fā)酵，pH值降至4.5時，將發(fā)酵液急冷后進行理化、微生物學和ACE抑制活性分析。

1.3.2 測定方法

（1）pH值測定，采用精密pH計（雷磁PHS-3C）測量。

（2）滴定酸度（Titratable Acidity，TA）測定采用濃度為0.1 mol/L的NaOH滴定法，吉爾涅爾度°T表示[10]。

（3）游離氨基氮（Free Amino Nitrogen，F(xiàn)AN）測定采用Lemieux等[11]和Church等[12]鄰苯二甲醛衍生比色法。

（4）黏度測定：發(fā)酵乳溫度至20℃時，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER粘度儀（Brookfield Engineering Laboratories，Inc，Middleboro，MA）4#轉(zhuǎn)子進行測定，轉(zhuǎn)速為100 r/min、扭矩為10%～100%、測定時間為30 s。

（5）脫水收縮性（Syneresis）測定：稱取15 g發(fā)酵乳樣品，置于帶有濾紙的漏斗中，21℃放置90 min，收集濾液并稱重，脫水收縮性=（濾液質(zhì)量/樣品質(zhì)量）×100%[13]。

（6）活菌數(shù)測定：發(fā)酵液用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)后，采用MRS瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，37℃培養(yǎng)48 h后計菌落總數(shù)[14-15]。

（7）發(fā)酵乳ACE抑制率測定，采用Yongfu Chen等[5]的高效液相色譜法。

（8）ACE抑制肽VPP和IPP含量測定，采用Yongfu Chen等[5]的液質(zhì)聯(lián)用儀（LC-MS）方法。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行分析處理。圖表利用Origin8.6繪制，平均值和標準偏差由三個平行樣品的測量結(jié)果計算得到。

表1 與L.helveticus H9進行復(fù)配發(fā)酵菌種信息

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵乳理化成分、活菌數(shù)和發(fā)酵時間

表2為各發(fā)酵乳理化及微生物指標結(jié)果。由表2可以看出，L.helveticus H9與Lactococcus lactis復(fù)配發(fā)酵乳的游離氨基氮濃度（（3.134±0.052）～（3.747±0.101）mmol/L）大于與其他種類乳酸菌復(fù)配發(fā)酵乳的游離氨基氮濃度，證明該組合在脫脂乳中具有較強的蛋白水解活性。與此同時，L.helveticus H9與Lactococcus lactis復(fù)配發(fā)酵乳的ACE抑制率、VPP和IPP濃度大于Streptococcus thermophilus和酸奶發(fā)酵劑組（見表3），且L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳的游離氨基氮濃度與ACE抑制率、VPP和IPP濃度顯著正相關(guān)（P＜0.01）（如圖1和圖2），以上結(jié)果證明游離氨基氮濃度的多寡能體現(xiàn)菌株水解能力的強弱，L.helveticus ACE抑制活性的強弱很大程度上受其水解能力影響[16]，該結(jié)果與Fuglsang等[17]的研究結(jié)果相一致。另外，在本研究的復(fù)配發(fā)酵乳發(fā)酵終點的L.helveticus H9活菌數(shù)對數(shù)值（（7.56±0.05）～（8.63±0.05）mL-1）大于國外發(fā)酵乳中規(guī)定的107mL-1的活菌數(shù)量[18]。L.helveticus H9與Lactococcus lactis復(fù)配發(fā)酵乳的脫水收縮（33.2%±6.8%）大于Streptococcus thermophilus和酸奶發(fā)酵劑組，展現(xiàn)出較好的持水特性。

2.2 ACE抑制率、VPP和IPP濃度與其他指標之間相關(guān)性

比較分析表2中18組不同的L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳與其單菌發(fā)酵乳的ACE抑制率、VPP和IPP濃度等主要指標發(fā)現(xiàn)，復(fù)配發(fā)酵組Streptococcus thermophilus IMAU40115、Lactococcus lactis subsp.cremoris IMAU60065、Lactococcus lactis subsp.cremoris IMA U60065、Lactococcus lactis subsp.cremoris IMAU 40011、L.delbrueckii subsp.bulgaricus IMAU20094和Streptococcus thermophilus IMAU40051的ACE抑制率大于60%，表現(xiàn)出較好的ACE抑制活性。此外，復(fù)配發(fā)酵組Streptococcus thermophilus IMAU40115、Lactococcus lactis subsp.cremoris IMAU60065、Lactococcus lactis subsp.cremoris IMAU60064、L.delbrue ckii subsp.bulgaricus IMAU20094和Streptococcus thermophilus IMAU40051的復(fù)配發(fā)酵乳的VPP和IPP濃度（（3.571±0.217）和（2.043±0.066）mol/L；（3.060±0.124）和（1.967±0.125）mol/L；（3.424±0.125）和2.136±0.159 mol/L；（3.706±0.655）和（2.020±0.015）mol/L）顯著高于其他組（P＜0.05）。隨后，由L.helveticus H9發(fā)酵乳的ACE抑制率與其他指標之間相關(guān)性分析（圖1）可知，發(fā)酵乳的ACE抑制率與VPP和IPP含量顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明降血壓肽VPP和IPP是L.helveticus H9發(fā)酵乳的主要ACE抑制活性成分。這個結(jié)果與Zinovia等的研究結(jié)果相一致[16]，但是也有一些研究證明其它活性多肽是ACE抑制活性的主要來源[19]。

圖1 發(fā)酵乳中ACE抑制率與其他指標間相關(guān)性

表2 L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳理化和微生物指標

圖2 發(fā)酵乳中VPP和IPP與其他指標間相關(guān)性

表3 不同復(fù)配菌種與L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳理化和微生物組成

基于L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳中的各測定指標，對L.helveticus H9發(fā)酵乳中的VPP和IPP含量與其他測定指標間也進行了相關(guān)性分析（圖2）。比較圖1和圖2可知L.helveticus H9發(fā)酵乳的ACE抑制率、VPP和IPP含量與其它指標相關(guān)性幾乎一致，從而進一步說明了ACE抑制肽VPP和IPP是L.helveticus H9發(fā)酵乳的主要ACE抑制活性成分。此外，L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳ACE抑制率與pH值呈顯著負相關(guān)（P＜0.01），而L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳的ACE抑制率與滴定酸度、脫水收縮性、活菌數(shù)、發(fā)酵時間呈正相關(guān)，但不顯著。

2.3 復(fù)配菌株種屬對發(fā)酵乳的影響

將L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳歸類成Streptococcus thermophilus組（實驗號1～7）、Lactococcus lactis組（實驗號8～14）和酸奶發(fā)酵劑組（實驗號15～18），并與L.helveticus H9單菌發(fā)酵乳進行了比較，其結(jié)果如表3所示。

由表3可知，L.helveticus H9與Lactococcus lactis復(fù)配發(fā)酵乳的ACE抑制率、IPP濃度、VPP濃度和游離氨基氮濃度顯著高于Streptococcus thermophilus和酸奶發(fā)酵劑組（P＜0.05），而且發(fā)酵乳的游離氨基氮濃度與ACE抑制率、IPP和VPP含量顯著正相關(guān)（P＜0.05）。此結(jié)果與L.helveticus H9具有較強的蛋白水解能力具有密切相關(guān)。在L.helveticus的水解系統(tǒng)中，蛋白酶首先把酪蛋白降解成大片段的多肽，隨后細胞內(nèi)的多肽酶把大片段的多肽降解成小片段的多肽和氨基酸，最后轉(zhuǎn)運蛋白將降解出的的氨基酸和多肽通過細胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運到細胞外[20]。復(fù)配發(fā)酵過程是一個各菌種相互作用的過程，可能存在互利共生或拮抗作用，復(fù)配發(fā)酵乳高ACE抑制率的獲得具有菌種屬的特異性，結(jié)合表3可知三種復(fù)配方式（實驗組6，8，10，14，16）中都包含ACE抑制率大于60%的復(fù)配菌種，證明和L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵的菌種具有菌種間特異性。與本研究類似，Minervini[21]等人的研究證明L.helveticus PR4與Streptococcus thermophilus CR12和Lactobacillus casei LC01的復(fù)配發(fā)酵羊奶的ACE抑制率為82.0%±1.70%，高于其它復(fù)配發(fā)酵乳。另外，三組復(fù)配發(fā)酵乳的pH值、黏度、脫水收縮性、活菌數(shù)和發(fā)酵時間等發(fā)酵指標差異不顯著。

由表3可看出，Streptococcus thermophilus組、Lactococcus lactis組和酸奶發(fā)酵劑組的ACE抑制率、VPP、IPP等主要指標雖有差異，但不顯著（P＞0.05），其原因為同一組內(nèi)的各菌株或發(fā)酵劑的發(fā)酵特性具有較大差異，從而未能顯示統(tǒng)計學意義。總體而言Lactococcus lactis較Streptococcus thermophilus和酸奶發(fā)酵劑（L.delbrueckii subsp.bulgaricus和 Streptococcus thermophilus）更適宜與L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵。而且，L.helveticus H9和Lactococcus lactis復(fù)配發(fā)酵乳的黏度、脫水收縮性和活菌數(shù)對數(shù)值分別為（1 575.3±285.7）Pa·s，33.2%±6.8%和（8.09±0.34）mL-1，顯示了較好的發(fā)酵特性。

3 結(jié)論

L.helveticus H9與生產(chǎn)特性優(yōu)良的17株菌種酸乳發(fā)酵劑復(fù)配發(fā)酵后，分析發(fā)現(xiàn)，Lactococcus lactis與L.helveticus H9復(fù)配發(fā)酵乳的ACE抑制活性、VPP和IPP濃度高于與Streptococcus thermophilus和酸奶發(fā)酵劑的復(fù)配發(fā)酵乳。此外，Lactococcus lactis組發(fā)酵乳的pH、粘度、脫水收縮性和發(fā)酵時間與L.helveticus H9單獨發(fā)酵乳無顯著差別，展現(xiàn)出一定的商業(yè)應(yīng)用潛力。本文對L.helveticus H9相關(guān)產(chǎn)品的后續(xù)研發(fā)，特別是復(fù)配菌株選育和產(chǎn)品開發(fā)提供了重要的研究基礎(chǔ)。

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