劉紅新，任艷，張冬蕾，楊彥榮，劉文俊，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引言

酸馬奶（koumiss）是中亞地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵馬乳飲料,又稱“馬奶酒”[1]。它以新鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌共同發(fā)酵而成，具有獨特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價值[2]。蒙醫(yī)藥典中也曾記載酸馬奶能開胃、祛濕、解毒潤膚等功效[3]。酸馬奶之所以具有與馬奶不同的功效，主要由于其微生物菌群以酵母菌群和乳酸菌群為主。乳酸菌是指發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類革蘭氏陽性、不產(chǎn)芽孢、過氧化氫酶陰性的一類細菌的總稱[4]，在人體內(nèi)具有諸多益生作用[5]。

本研究采用實驗室純培養(yǎng)的方法分離、鑒定錫林郭勒地區(qū)傳統(tǒng)酸馬奶中的乳酸菌，通過16S rDNA序列分析的方法對乳酸菌分離株進行鑒定，并分析其優(yōu)勢菌群，保護我國益生菌資源，為傳統(tǒng)酸馬奶的篩選和開發(fā)利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本研究中27份酸馬奶樣品由實驗室的研究人員于2014年7月16日—2014年7月18日在內(nèi)蒙古錫林郭勒的不同地區(qū)采集。樣品采集后低溫保存，帶回實驗室于-80℃超低溫保藏，進行后續(xù)實驗。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基，MRS液體培養(yǎng)基，M17固體培養(yǎng)基，M17液體培養(yǎng)基。

實驗所用試劑：PBS保護液，PBS緩沖液，脫脂乳保護劑，提取DNA所用試劑，PCR擴增和電泳檢測所用試劑[6]。

1.1.3 儀器與設(shè)備

便攜式冰箱，溫度計，便攜式PH計，采樣箱等。

ZHJH-C1214C型超凈工作臺，TGL-168高速臺式離心機，HWS28型電熱恒溫水浴鍋，AR2202CN型電子天平，KDC-1044型低速離心機，LRH-250生化培養(yǎng)箱，BX50型光學(xué)顯微鏡，HA-300M型全自動高壓蒸汽滅菌器，SP-650型全自動高壓干熱滅菌器，WD-9405B型水平搖床，LL-6SFPY型真空冷凍干燥機，PTC-200梯度基因擴增儀；DYY-12型電泳儀，GDS-8000型凝膠成像儀，ND-1000型微量紫外分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

本試驗在采集乳樣品時采用直接取樣法。先將容器中的發(fā)酵乳制品充分混勻，再用移液槍吸取1.5 mL樣品至裝有滅菌中和劑（內(nèi)含0.5 g,CaCO3：淀粉=1∶50，質(zhì)量比）的2.5 mL無菌螺口凍存管中，混勻后標記樣品號并作記錄，封口保存。最后將采集的乳樣置于4℃便攜式冰箱中以維持其低溫狀態(tài)，盡快帶回實驗室進行乳酸菌的分離純化等實驗。

1.2.2 樣品中乳酸菌的計數(shù)

乳酸菌計數(shù)根據(jù)參考文獻[7]采用傾注培養(yǎng)法。計數(shù)即為每mL樣品的菌落數(shù)。

1.2.3 樣品中乳酸菌的分離純化及保存

分別吸取 0.2 mL稀釋度為10-5，10-6，10-7稀釋液于MRS固體培養(yǎng)基上涂布后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)48 h，待菌落形成后，隨機挑取形態(tài)學(xué)特征各不相同的單個菌落于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。將不純的菌株在MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離，37℃培養(yǎng)48 h，如此反復(fù)2～3次，直至鏡檢結(jié)果為純的單菌后編號并接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基進行擴培和傳代。

選取過氧化氫陰性、革蘭氏陽性的純培養(yǎng)物，將此培養(yǎng)物暫定為乳酸菌，加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%谷氨酸鈉的脫脂乳保護劑，混勻后置于-80℃保存?zhèn)溆?。同時，另一份樣品進行DNA提取和后續(xù)鑒定實驗。

1.3 16S rDNA序列分析

1.3.1 總DNA的提取及純度的檢測

采用液氮反復(fù)凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[8]。再用ND-1000型微量紫外分光光度計測其濃度以及OD260/280值。再用質(zhì)量分數(shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR擴增

16S rRNA基因的PCR擴增引物序列為

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[9]。

PCR擴增體系（模板為上述DNA稀釋液）：5 μL10×EasyTaq Buffer（+Mg2+）；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物 FA-27F（濃度 10 mmol/L）；1.5 μL 引 物 RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模板（質(zhì)量濃度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR擴增循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72℃末端延伸10 min。

擴增完畢后，取約2 μL的PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在1 500 bp處有清晰的擴增條帶且無拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR擴增成功[10]。將PCR擴增產(chǎn)物送往上海美吉生物公司進行純化和DNA測序。

1.4 同源性分析

將測序得到的DNA序列運用SeqMan（DNAStar 5.01）軟件進行序列拼接后，再利用NCBI中的BLAST將拼接好的序列與數(shù)據(jù)庫中已鑒定的乳酸菌16S rDNA序列進行同源性分析，將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應(yīng)用MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行遺傳進化研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離株的菌落形態(tài)及細胞形態(tài)特征

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征[11-12]，初步從27個酸馬奶樣品中共分離出83株疑似乳酸菌的菌株。經(jīng)過革蘭氏染色、過氧化氫酶反應(yīng)，均為革蘭氏陽性，過氧化氫陰性菌[13]。初步將83株菌定為乳酸菌。

2.2 乳酸菌計數(shù)結(jié)果

錫林郭勒地區(qū)酸馬奶中乳酸菌的活菌數(shù)如表1所示。

由表1可以看出，酸馬奶樣品中乳酸菌數(shù)在4.44～8.99 mL-1（對數(shù)值）之間。平均值為（6.09±0.13）mL-1（對數(shù)值）。其中XM3，XM4，XM14等樣品中乳酸菌活菌數(shù)低于106/mL-1，低于酸奶國家標準。大部分菌株的活菌數(shù)高于106mL-1，符合新的酸奶國家標準和國家衛(wèi)生標準，有利于進一步分離與研究。由于本次采樣，并未按照特定時間點進行，是隨機采樣，有的地點樣品發(fā)酵和貯藏時間長，有的樣品發(fā)酵和貯藏時間短，所以其中乳酸菌活菌數(shù)量存在較大差異。李道敏,劉開永等人[14]對木糖醇酸奶發(fā)酵、貯藏期間質(zhì)量變化做過研究，閆志國[15]對發(fā)酵乳在貯藏期間的理化性質(zhì)的變化也做過詳細報道，均闡述自然發(fā)酵乳制品中微生物隨著發(fā)酵和貯藏時間的延長，乳酸菌種屬和數(shù)量有較大的變化。

表1 內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)酸馬奶中乳酸菌計數(shù)結(jié)果 mL-1

2.3 乳酸菌分離鑒定結(jié)果

2.3.1 DNA提取和PCR擴增結(jié)果

DNA濃度和OD260/280值的測定：提取83株乳酸菌的DNA并測其濃度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0之間即為純DNA樣品。將DNA原液稀釋至濃度為100 ng/μL后進行16S rRNA基因的PCR擴增。擴增結(jié)果經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，可以觀察到在大約1 500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無拖尾、彌散現(xiàn)象，未發(fā)現(xiàn)明顯非特異擴增現(xiàn)象，說明分析菌株的16S rRNA基因擴增成功。將PCR擴增產(chǎn)物送于上海美吉生物科技有限公司進行測序。

圖1 部分分離菌DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.3.2 16S rRNA基因同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序獲得的16S rRNA基因序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST進行同源序列比對分析,若同源性高于99%則可直接將其歸為此種模式株菌種，選取部分具有代表性的菌株用 MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分離株與模式株系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2（選取部分作圖）：

圖2 內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)代表性分離株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出，所有分離株聚為2個大的類群，一個類群為桿菌，一個類群為球菌，IMAU11650（KR858843）與模式菌Enterococcus durans ATCC19432（AJ276354）聚為一類，同源性分別為100%，將其鑒定為 Enterococcus durans。IMAU11655（KR858848）與模式菌Enterococcus faecium ATCC19434（AJ301830）聚為一類，同源性為100%，因此將歸其為Enterococcus faecium。IMAU11642（KR858836）與模式菌Enterococcus devriesei CCM7299（AJ891167）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Enterococcus devriesei。IMAU11152（KR858806）與模式菌Enterococcus faecalis JCM5803（AB012212）聚為一類，同源性為100%，故鑒定為Enterococcus faecalis。IMAU11668（KR858860）與模式菌Enterococcus italicus DSM 15952（AJ582753）聚為一類，同源性為 100%，故將其鑒定為Enterococcusitalicus。IMAU11124（KR858778）與模式菌Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC19435（AB100803）聚為一類，同源性為100%,故鑒定為Lactococcus lactis subsp.Lactis。IMAU11138（KR858792）與模式菌Streptococcus parauberis DSM6631（AY584477）聚為一類，同源性為99%，故將其歸為為Streptococcus parauberis。IMAU11641（KR858835）與模式菌Lactobacillus plantarum ATCC14917（AJ965482）聚為一類，同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus plantarum。IMAU11674（KR858866）與模式菌Lactobacillus diolivorans DSM14421（AF264701）聚為一類，同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillusdiolivorans。IMAU11656（KR858849）與Lactobacillus casei ATCC393（AF469172）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Lactobacillus casei。 IMAU11657（KR858850）與模式菌Lactobacillus paracasei ATCC25302（D79212）聚為一類，同源性為100%，因此將其鑒定為Lactobacillus paracasei。IMAU11644（KR858838）與模式菌Lactobacillus helveticus ATCC15009（AM113779）聚為一類，同源性分別為99%，故鑒定為 Lactobacillus helveticus。IMAU11126（KR858780）與模式菌 Lactobacillus kefiranofaciensDSM 5016（AM113781）聚為一類，同源性為99%故，將其鑒定為Lactobacillus kefiranofaciens。IMAU11158（KR858812）與模式菌 Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291（AB023237）聚為一類，同源性分別為99%，故鑒定為Leuconostoc pseudomesenteroides。IMAU 11125（KR858779）與模式菌Leuconostoc mesenteroides NCFB529（AB023244）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Leuconostoc mesenteroides。根據(jù)16S rDNA序列分析，分離的83株菌中，49株菌與模式菌株的同源性達到99%，34株菌與模式菌株的同源性達到100%。

2.4 錫林郭勒地區(qū)酸馬奶中乳酸菌的優(yōu)勢菌種分析

乳酸菌的分布結(jié)果如表2所示。

表2 內(nèi)蒙古錫林郭勒地區(qū)酸馬奶中乳酸菌的分離結(jié)果

由表2可以看出，27份酸馬奶樣品中分離出的83株乳酸菌疑似菌株，經(jīng)16S rDNA序列測定和同源性分析鑒定，分屬于5個屬15個種或亞種。其中錫林郭勒地區(qū)的優(yōu)勢菌群為Lactococcus lactis subsp.lactis，占總分離株的34%。近幾年，孫天松[16]等人對新疆地區(qū)酸馬奶進行分離鑒定，其優(yōu)勢菌種為Lactobacillus helveticus。劉芳、都立輝[17]等人對內(nèi)蒙古酸馬奶多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)Lactococcus lactis為優(yōu)勢菌群。魏艷、曾小群[18]等人對新疆酸馬奶中乳酸菌分離鑒定，結(jié)果表明優(yōu)勢菌群為發(fā)酵乳桿菌和干酪乳桿菌。由此可見不同地區(qū)酸馬奶優(yōu)勢菌種不同，即使同一地區(qū)采樣時間、貯藏時間不同，結(jié)果也會有差異。

3 結(jié)論

本研究對27份錫林郭勒地區(qū)酸馬奶樣品進行乳酸菌的分離鑒定，共分離出83株乳酸菌。通過16S rDNA序列同源性分析，將83株乳酸菌鑒定為5個屬，15個種或亞種，分別屬于乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬。其中Lactococcus lactis subsp.Lactis為錫林郭勒地區(qū)酸馬奶中的優(yōu)勢菌種，占總分離株的34%。

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