康祥錦，丁 悅，楊 潔，杜紅姿，劉見橋，黃天華*

（1. 廣 州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150；2. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 汕頭 515041）

乙肝病毒S蛋白誘導(dǎo)人精子凋亡的分子機(jī)制

康祥錦1，丁 悅1，楊 潔1，杜紅姿1，劉見橋1，黃天華2，*

（1. 廣 州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510150；2. 汕 頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣東 汕頭 515041）

乙肝病毒（ hepatitis B virus，HBV）感染給人類健康和生命帶來嚴(yán)重威脅。乙肝病毒表面S蛋白（HBV S protein，HBs）作為HBV的亞病毒顆粒主要組成部分，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于HBV顆粒。在慢性乙肝患者體內(nèi)HBV能夠自我組裝成大量分泌性的亞病毒顆粒，總濃度可達(dá)50～300 mg/mL［1］。2008年，Zhou等［2］將人精子與HBs蛋白體外共孵育，發(fā)現(xiàn)HBs能夠引起精子線粒體膜電位、精子活力、受精能力顯著下降，并導(dǎo)致精子大量死亡。Moretti等［3］發(fā)現(xiàn)乙肝患者精子的活力比正常人精子活力降低且有較高比例的凋亡和壞死。但其中涉及的具體機(jī)制仍未闡明。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞自主的、有序的死亡。生精細(xì)胞的凋亡可以維持精子發(fā)生過程的動態(tài)平衡，以維持成熟精子的質(zhì)量和數(shù)量。精子凋亡與男性不育關(guān)系密切。精子過度凋亡可能是引起特發(fā)性少精、弱精、畸形精子癥的原因［4-5］。人類射出的精子中也存在凋亡現(xiàn)象并顯示了一些凋亡特征的改變，如活性氧升高、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine， PS）外翻、線粒體膜電位降低、Caspases的激活和DNA片段形成等［6-8］。本研究擬通過探討HBs誘導(dǎo)人精子凋亡的分子機(jī)制，以揭示HBV感染引起男性患者生育力下降的原因，為進(jìn)一步研究提高男性生育力的措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HBs購自華北制藥金坦生物技術(shù)有限公司（純度＞99%）。BWW培養(yǎng)基各成分（分析純）和牛血清白蛋白均購自Sigma公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒，Caspase-3、-8、-9檢測試劑盒，F(xiàn)ragELTMDNA片段檢測試劑盒均購自德國MERCK公司。

1.2 精子樣本處理

采用健康志愿者提供的精液標(biāo)本（HIV、HBV和HCV檢測均為陰性） 。精液樣本于無菌燒杯中在培養(yǎng)箱（ 37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%） 中液化30 min。液化后的精液分裝于5 mL玻璃試管中，每管約1 mL，緩緩加入2 mL BWW培養(yǎng)基（含0.3%牛血清白蛋白），在37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中待精子上游1.5 h后取上清300 g離心5min。棄上清，BWW培養(yǎng)基洗滌2次后，用BWW培養(yǎng)基調(diào)節(jié)精子濃度為1×106/mL后備用。

1.3 精子與HBs共孵育

將0.5 mL精子樣本（1×106/mL）分別與不同終濃度的HBs蛋白（0、25、50、100 μg/mL）在CO2培養(yǎng)箱（37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）中共孵育3 h后，檢測HBs對人精子凋亡各項(xiàng)指標(biāo)的劑量效應(yīng)。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測精子磷脂酰絲氨酸外翻

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，Annexin-V與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測標(biāo)志事件。本研究采用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Annexin V結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對精子PS外翻情況進(jìn)行檢測。取1×106/mL的精子懸液0.5 mL，分為4組，分別為與0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h組。將各處理組精子室溫1 000 g離心5 min，棄上清；用0.5 mL預(yù)冷的PBS溶液重懸精子；室溫1 000 g離心5 min，棄上清液；再用0.5 mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液（Annexin VFITC/PS凋亡檢測試劑盒）輕搖重懸精子；加入1.25 μL Annexin V-FITC；室溫（18～24 ℃）避光反應(yīng)15 min后，室溫1 000 g離心5 min，棄上清；加入10 μL 碘化丙啶（PI）；將樣本置于冰上避光保存并用流式細(xì)胞儀在波長488 nm處檢測。

1.5 精子內(nèi)Caspase-3、-8、-9激活的檢測

Caspase的活化是凋亡的典型特征。本實(shí)驗(yàn)采用FITC標(biāo)記的抑制劑檢測HBs蛋白對人精子內(nèi)Caspase活化的影響。取1×106/mL的精子懸液0.5 mL，分別與0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h，并設(shè)置HBs+1μL/mL Caspase抑制劑Z-VAD-FMK共孵育的人精子對照組。將各處理組精子1 000 g離心5 min，棄上清液，輕輕混勻；實(shí)驗(yàn)組精子分別加入1 μL FITC-DEVDFMK、FITC-IETD-FMK、FITC-LEHD-FMK（依次檢測Caspase-3、-8、-9）至各處理組，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h；將精子沉淀離心洗滌2次；后用300 μL洗滌緩沖液重懸精子，并置于冰上；上流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 精子內(nèi)DNA損傷的檢測

在凋亡晚期細(xì)胞中，DNA被降解為不同大小的片段，本研究將FITC標(biāo)記和未標(biāo)記的dNTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA片段的3′-OH末端，流式細(xì)胞儀檢測HBs蛋白對人精子DNA損傷的影響。取1×106/mL的精子懸液0.5mL，分別與0、25、50、100 μg/mL HBs孵育3 h，每組5個(gè)樣本。將各處理組精子4 ℃、1 000 g離心5 min后，于4%的甲醛溶液中室溫固定10m in；4℃ 、1000g 離 心5 min，去除固定液；用80% 乙醇溶液以相同細(xì)胞密度重懸；室溫1 000 g 離心 5 min，棄上清液；用200 μL TBS溶液重懸精子；室溫 1 000g 離心5m in，去除TBS溶液；將精子重懸于100μ L 20μ g/mL的蛋白酶K溶液中，室溫孵育5 min；室溫1 000 g離心5 min，去除蛋白酶K溶液；用100 μL 1×TdT 緩沖液重懸精子，室溫孵育10～30 min后，室溫1 000 g 離心5 min，去除平衡緩沖液；將細(xì)胞重懸在60 μL標(biāo)記反應(yīng)混合物溶液（Biotin-FragELTMLabeling Reaction Mix、3 μL TdT酶），陰性對照的標(biāo)記反應(yīng)混合物中加入同體積蒸餾水；37 ℃ 避光孵育 1～1.5 h；室溫1 000 g離心5 min，去除標(biāo)記反應(yīng)混合物；將細(xì)胞重懸于200 μL TBS 溶液中。重復(fù)清洗后將細(xì)胞重懸于0.5m L T BS溶液中；上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)分析

所有標(biāo)記精子的熒光信號均通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每份樣本至少檢測10 000個(gè)精子，細(xì)胞流速為每秒50～500個(gè)細(xì)胞。激發(fā)波長為488 nm。應(yīng)用Cell Quest與Win MDI 2.9軟件分析陽性精子的比率和平均熒光強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HBs誘導(dǎo)人精子膜磷脂酰絲氨酸外翻

見圖1。根據(jù)正常對照組及實(shí)驗(yàn)組FITC及PI熒光作雙參數(shù)點(diǎn)圖，將細(xì)胞分為4個(gè)區(qū)：左上區(qū)，機(jī)械損傷細(xì)胞（Annexin V-FITC-/PI+）；右上區(qū)，凋亡晚期或壞死細(xì)胞（Annexin V-FITC+/PI+）；左下區(qū)，活細(xì)胞（Annexin V-FITC-/PI-）；右下區(qū)，早期凋亡細(xì)胞（Annexin V- FITC+/PI-）。25、50、100 μg/mL HBs 處理人精子3 h后，實(shí)驗(yàn)組（圖1B）的Annexin V- FITC+/PI-精子比例顯著高于對照組（圖1A）（P＜0.01）。此結(jié)果表明，人精子與HBs蛋白共孵育后可通過引起精子膜磷酯酰絲氨酸外翻導(dǎo)致精子胞膜功能異常。此外，人精子經(jīng)不同濃度HBs（0、25、50、100 μg/mL）處理3 h后，磷脂酰絲氨酸的外翻即Annexin V- FITC+/PI-的精子比率分別為1.39%±0.77%、5.95%±1.33%、15.55%±6.15%、28.55% ±13.98%，HBs對人精子胞膜磷脂酰絲氨酸外翻的影響呈劑量依賴趨勢（表1）。

2.2 HBs誘導(dǎo)人精子內(nèi)Caspase-3、-8、-9的活化

HBs蛋白對人精子內(nèi)Caspase-3、-8、-9活化的影響如圖2所示：25 μg/mL HBs處理組Caspase-3、-8、-9 陽性精子的比率分別為53.01%、45.34%、59.31%（圖2D～F），而對照組分別為40.59%、28.10%、36.29% （圖2A～C）。結(jié)果顯示，25 μ g/mL H Bs處理組的Caspase-3、-8、-9陽性比率均顯著高于對照組（P＜0.05）。此結(jié)果表明，HBs可以誘導(dǎo)人精子內(nèi)Caspase-3、-8、-9的活化。人精子經(jīng)不同濃度HBs（0、25、50、100 μg/mL）處理3h后，Caspase-3、-8、-9陽性精子比率均較對照組明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），表明人精子經(jīng)不同濃度HBs處理后Caspase-3、-8、-9的激活與HBs呈劑量依賴趨勢（表1）。

2.3 HBs對人精子DNA損傷的影響

圖3和表1顯示了HBs蛋白對人精子DNA損傷的影響，人精子與25μg/mL HBs共孵育3 h后，TUNEL陽性精子比率顯著高于對照組（P＜0.01）。人精子經(jīng)不同濃度HBs（0、25、50、100 μg/mL）處理3 h后，精子內(nèi)DNA損傷水平與HBs呈劑量依賴效應(yīng)的趨勢（表1）。

3 討 論

細(xì)胞凋亡在眾多病理和生理過程中發(fā)揮重要作用［9］。男性生殖細(xì)胞的異常凋亡可通過影響精子的質(zhì)量包括精子存活力、活率、形態(tài)異常等缺陷而引起男性不育［10-11］。HBV可通過損傷精子功能導(dǎo)致男性不 育［12］。已證實(shí)HBV病人的平均精液濃度、精子活力、活率、形態(tài)異常及含有高比例凋亡和壞死精子。HBs 作為HBV的亞病毒顆粒主要組成部分，可導(dǎo)致慢性HBV攜帶者持續(xù)的肝臟炎癥和損傷。盡管病毒感染可以影響患者的生育能力，但HBV感染對精子功能影響的分子機(jī)制仍鮮有報(bào)道。

表1 HBs對人精子凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響（±s，%，n=5）

與對照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01.

組別A n n e x i n V -F I T C / P I精子+ -C a s p a s e -3陽性精子C a s p a s e -8陽性精子C a s p a s e -9陽性精子T U N E L陽性精子對照組1. 39 ± 0. 7 7 45. 07 ± 10. 48 37 . 18 ± 3. 46 27 . 23± 3. 8 012. 8 1± 3. 8 0H B s 25 μ g / m L 5. 9 5± 1. 33* * 54. 34± 3. 37 * 56 . 7 4± 2. 11* 45. 26 ± 3. 8 4* * 27 . 04± 3. 12* * 50 μ g / m L 15. 55± 6 . 15* * 56 . 49 ± 6 . 27 * 59 . 7 2± 3. 32* 49 . 12± 3. 7 2* * 56 . 29 ± 7 . 15* * 100 μ g / m L 28 . 55± 13. 9 8 * * 6 2. 13± 12. 7 1* * 6 2. 54± 3. 43* 6 4. 7 0± 3. 7 6 * * 6 0. 53± 9 . 7 6 * *

本研究通過Annexin V-FITC/PI雙染、Caspases活化、TUNEL等實(shí)驗(yàn)探討HBs是否可導(dǎo)致人精子凋亡。磷脂酰絲氨酸外翻是精子早期凋亡的指征，Annexin V陽性精子的比率與精子參數(shù)及精子受精能力呈顯著負(fù)相關(guān)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)人精子與25 μg/mL HBs共孵育3h后Annexin V-FITC+/PI-精子比率顯著升高（P＜0.01），磷脂酰絲氨酸外翻與HBs（0、25、50、100 μg/mL）呈劑量依賴關(guān)系。此結(jié)果表明HBs能導(dǎo)致人精子胞膜磷脂酰絲氨酸外翻而引起精子早期凋亡。

許多來自細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的刺激可以啟動細(xì)胞凋亡，如細(xì)胞毒劑暴露、輻射、DNA損傷、氧化應(yīng)激等。Caspases在細(xì)胞凋亡的起始和執(zhí)行過程中發(fā)揮著重要的作用［14］。已證實(shí)人精子中存在激活的Caspase-3、-8、-9，且Caspases的激活與低生育力有關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)人精子與25 μg/mL HBs共孵育后，Caspase-3、-8、-9水平與對照組相比均顯著升高（P均＜0.01）， 且Caspase-3、-8、-9的激活與HBs（0、25、50、100 μg/mL）呈劑量依賴性。此結(jié)果表明HBs可誘導(dǎo)人精子內(nèi)Caspase-3、-8、-9激活。DNA斷裂為細(xì)胞凋亡的晚期事件。本研究發(fā)現(xiàn)精子和HBs共孵育3 h后，精子內(nèi)DNA損傷片段顯著高于對照組（P＜0.01）。此結(jié)果表明HBs能導(dǎo)致精子DNA損傷，且與HBs（0、25、50、100μg/mL）呈劑量依賴趨勢。

Zhou等［2］研究表明，HBs可誘發(fā)精子線粒體膜電位喪失，精子線粒體膜電位的喪失使得精子缺乏能量難以維持其活力；Caspase依賴性凋亡和Caspase非依賴性凋亡的轉(zhuǎn)換及DNA損傷可能會啟動精子的死亡通道。所有這些事件的最終可影響精子的正常功能，或?qū)е戮拥乃劳?，從而引起精子活力降低或受精能力下降。本研究有力的證明了乙肝病毒HBs蛋白可通過Caspase依賴和Caspase非依賴的途徑引起人精子凋亡，為揭示HBs降低人精子受精能力的機(jī)制供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Study of the mechanisms of human sperm apoptosis by hepatitis B virus S protein

KANG Xiangjin1，DING Yue1，YANG Jie1，DU Hongzi1，LIU Jianqiao1，HUANG Tianhua2，*
（1. Center for Reproductive Medicine， Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Key Lab for Reproductive Medicine of Guangdong Province， Key Lab for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province， Key Lab of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institute， Guangzhou 510150；2. Research Center for Reproductive Medicine， Shantou University Medical College， Shantou 515041， Guangdong， China）

目的： 探討乙肝病毒S蛋白（HBs）誘導(dǎo)人精子凋亡的分子機(jī)制。方法：人精子與不同濃度（0、25、50、100 μg/mL）HBs共孵育3 h后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測HBs對精子早期凋亡指標(biāo)磷脂酰絲氨酸外翻情況，用流式細(xì)胞術(shù)檢測精子細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶-3、-8、-9（Caspase-3、-8、-9）活化，用TUNEL結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測精子DNA的損傷。結(jié)果：人精子與25～100 μg/mL HBs共孵育3 h后，Annexin V-FITC+/PI-精子，Caspase-3、-8、-9陽性精子，TUNEL陽性精子的比率均顯著高于對照組（P＜0.05或P＜0.01），且均呈劑量依賴趨勢。結(jié)論：25～100 μg/mL HBs可誘發(fā)人精子胞膜磷脂酰絲氨酸外翻，胞內(nèi)Caspase-3、-8、-9激活和DNA損傷，從而致使人精子凋亡以影響精子的功能。

HBs；凋亡；胞膜完整性；精子功能

OBJECTIVE:To explore the mechanisms of human sperm apoptosis by hepatitis B virus S protein.METHODS：After the co-incubation of sperms with 0，25，50 and 100 μg/mL HBS for 3 h，the externalization of membrane phosphatidylserine （PS）；Caspase-3，-8，-9 activation and DNA fragmentation of human sperm were assessed.RESULTS：After incubation，the average rates of Annexin V-positive/propidium iodide （PI）-negative sperm，Caspase-3，-8，-9 positive sperm and TUNEL-positive sperm were significantly increased in the test groups as compared to those in the control groups （P＜0.05 or P＜0.01），and in a dose-dependent manner.CONCLUSION：HBs exposure could lead to PS externalization，activation of caspases，and DNA fragmentation，resulting in increased apoptosis of sperms and causing sperm dysfunction.

HBs；apoptosis；membrane with normal integrity；sperm function

Q291

A

1004-616X（2015）01-0044-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.010

2014-11-19；

2014-12-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81401254）；廣東省人口和計(jì)劃生育委員會資助項(xiàng)目（20133064）；廣州市荔灣區(qū)科技和信息化局資助項(xiàng)目（20131215083）；廣州醫(yī)科大學(xué)博士啟動資金（2012C52）

作者信息：康祥錦，E-mail：kangxiangjin@163.com。*通信作者，黃天華，E-mail：t hhuang@stu.edu.cn