歐紅梅，周長慧，涂宏剛，黃鵬程，常 艷*

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，國家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

流式細(xì)胞術(shù)檢測體外微核方法的建立

歐紅梅，周長慧，涂宏剛，黃鵬程，常 艷*

（中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，國家上海新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，上海 201203）

體外微核試驗(yàn)以微核作為遺傳毒性檢測終點(diǎn)，可用于染色體斷裂劑及非整倍體誘導(dǎo)劑的檢測，在化合物遺傳毒性評(píng)價(jià)的體外試驗(yàn)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位。2008年，歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）發(fā)布了體外微核試驗(yàn)可以替代體外染色體畸變?cè)囼?yàn)用于遺傳毒性檢測的指導(dǎo)原則［1］。2010年，體外微核試驗(yàn)被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）指導(dǎo)原則TG487列入體外遺傳毒性試驗(yàn)的選擇之一［2］。2011年，體外微核試驗(yàn)被國際協(xié)調(diào)委員會(huì)（International Conference on Harmonization， ICH）列入指導(dǎo)原則S2R（1）［3］。體外微核試驗(yàn)檢測方法簡單，易于自動(dòng)化［4-7］。流式細(xì)胞術(shù)作為微核自動(dòng)化檢測方法之一，具有高效、準(zhǔn)確、客觀及操作簡單等優(yōu)勢［8］。

本研究的目的是建立流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測方法，探討此方法用于藥物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評(píng)價(jià)的可能性。本試驗(yàn)以絲裂霉素C（mitomycin C，MMC）和環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）為陽性藥，分別以流式細(xì)胞儀檢測和人工閱片為微核檢測方法，并對(duì)兩種檢測方法得到的微核率進(jìn)行相關(guān)性分析。流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測采用96孔板EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記技術(shù)，并加入計(jì)數(shù)珠以評(píng)價(jià)化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性；人工閱片采用細(xì)胞分裂阻滯法，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中處理，處理完成后進(jìn)行低滲、固定、滴片，讀片前用吖啶橙染色。此外本文采用流式細(xì)胞術(shù)分析EMA染色情況獲得細(xì)胞毒性信息，分析SYTOX G reen染色情況評(píng)價(jià)MMC和CP對(duì)細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中國倉鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cells，CHO-K1）購自ATCC；DMEM/F-12培養(yǎng)基購自Corning公司；胎牛血清和Trypsin-EDTA（1×）購自Gibco公司；MMC購自Roche公司；CP和細(xì)胞松弛素B（cytochalasin B，CytoB）購自Sigma公司；S9購自Moltox公司；In V itro M icroFlow?K it 由 Litron L abs提供；6 Micron Fluorescent Latex Microspheres購自Invitrogen公司；流式細(xì)胞儀為BD公司的ACCURITMC 6。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇CHO-K1細(xì)胞，培養(yǎng)于含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)條件下維持培養(yǎng)。每周傳代2～3次，準(zhǔn)備足夠量的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞供試驗(yàn)使用。

1.2.2 受試物溶液和代謝活化系統(tǒng) MMC和CP以無菌去離子水為溶劑。MMC和CP的最高濃度分別為0.2和15 μg/mL。代謝活化系統(tǒng)是S9和輔助因子的混合物，S9的終濃度為1%（V/V），臨用前新鮮配制。

1.2.3 加樣處理 加樣前1天用0.25%的胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至所需。96孔板接種密度分別為每孔4.0×103個(gè)（-S9處理組）和6.0×103個(gè)（+S9處理組）細(xì)胞，平皿（100 mm）接種密度為每皿8.0×105～1.0×106個(gè)細(xì)胞，接種后在37 ℃、CO體

2 積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)過夜。

試驗(yàn)分為-S9持續(xù)處理組（處理時(shí)間為24 h），選擇0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3個(gè)濃度的MMC處理；+S9短時(shí)處理組（處理時(shí)間為4 h），選擇3.75、7.50和15.00μg/mL 3個(gè)濃度的CP處理。每個(gè)濃度設(shè)置 2個(gè)復(fù)孔，加樣后24 h后收獲細(xì)胞并進(jìn)行微核檢測。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測

流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測方法不加CytoB阻滯，采用EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記技術(shù)。EMA和SYTOX Green染液包括在試劑盒中，EMA熒光信號(hào)收集在FL3通道，SYTOX Green熒光信號(hào)由FL1通道收集。EMA可穿過凋亡或壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，在光活化條件下與DNA以共價(jià)鍵結(jié)合，但無法穿過正常細(xì)胞膜與DNA結(jié)合；EMA染色結(jié)束時(shí)采用緩沖液洗細(xì)胞，并用含RNA酶及細(xì)胞膜裂解液的SYTOX Green染液染色所有細(xì)胞的細(xì)胞核。通過EMA和SYTOX Green雙染料染色以區(qū)分正常細(xì)胞和凋亡、壞死細(xì)胞，達(dá)到排除凋亡或壞死細(xì)胞對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響的目的，并加入計(jì)數(shù)珠用于評(píng)價(jià)化合物的細(xì)胞毒性。

細(xì)胞收獲前可在顯微鏡下觀察，選擇合適的濃度收獲細(xì)胞，制備樣品并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)微核檢測。樣品檢測前，用陰性對(duì)照孔調(diào)試模板，保證需要的細(xì)胞都在邏輯門內(nèi)。每個(gè)濃度檢測分析不少于20 000個(gè)細(xì)胞。按下式計(jì)算相對(duì)存活率和微核率。

1.4 顯微鏡閱片

人工閱片采用細(xì)胞分裂阻滯的體外雙核微核試驗(yàn)，CytoB分別在加樣（-S9處理組）和換液（+S9處理組）時(shí)加入，終濃度為4 μg/mL。收獲細(xì)胞并進(jìn)行低滲、3次固定、滴片，0.1%的吖啶橙染色。吖啶橙熒光染色的玻片不宜長期保存，故讀片前染色。選擇背景清晰、分散良好、染色適宜的細(xì)胞觀察。每個(gè)濃度計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)細(xì)胞（包括單核、雙核和多核細(xì)胞），并計(jì)算胞質(zhì)分裂阻滯指數(shù)（cytokinesis-block proliferation index，CBPI）以評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。每個(gè)濃度計(jì)數(shù)不少于2000個(gè)完整的雙核細(xì)胞以評(píng)價(jià)雙核細(xì)胞的微核率。

其中，T：處理組；C：溶劑對(duì)照組。

1.5 結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

CHO-K1細(xì)胞相對(duì)存活率應(yīng)不低于50%±5%，如果無明顯細(xì)胞毒性的限制，最高濃度為2 000 μg/mL。每一個(gè)受試物的每一個(gè)處理?xiàng)l件下至少需要3個(gè)可分析的濃度。至少一個(gè)濃度的微核率和溶劑對(duì)照相比有顯著性差異，且有濃度-效應(yīng)關(guān)系，則判定為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.1.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，微核率比較使用Fisher精確概率法、四格表卡方檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。人工閱片和流式體外微核檢測方法的比較采用非參數(shù)Spearman系數(shù)分析［9-11］。

2 結(jié) 果

2.1 MMC體外微核試驗(yàn)結(jié)果

0.06、0.13 和0.25 μg/mL 3個(gè)濃度的MMC持續(xù)處理CHO-K1細(xì)胞24 h后，相對(duì)存活率均大于50%，人工閱片和流式細(xì)胞術(shù)兩種方法檢測的微核率與溶劑對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)顯著性差異（P均＜0.05），且有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。兩種檢測方法中，MMC誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞產(chǎn)生的微核率均是溶劑對(duì)照組的2倍以上，且微核率倍數(shù)均隨著濃度的升高而增大（見表 1）。相同濃度MMC條件下，兩種檢測方法得到的微核率采用SAS非參數(shù)Spearman系數(shù)分析得到rs=1.000，提示兩種檢測方法相關(guān)性好。

2.2 CP體外微核試驗(yàn)結(jié)果

3.75、7.50 和15.00 μg/mL 3個(gè)濃度的CP處理CHOK1細(xì)胞4 h后，相對(duì)存活率均大于50%，得到人工閱片和流式細(xì)胞儀兩種方法檢測的微核率與溶劑對(duì)照組相比，均呈現(xiàn)顯著性差異（P均＜0.05），且有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系（見表1）。兩種檢測方法得到中，CP誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞產(chǎn)生的微核率均是溶劑對(duì)照組的2倍以上，且微核率倍數(shù)均隨著濃度的升高而增大（見表 1）。相同濃度CP條件下，兩種檢測方法得到的微核率采用SAS非參數(shù)Spearman系數(shù)分析得到rs= 1.000，提示兩種檢測方法相關(guān)性好。

2.3 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果

MMC和CP作用于CHO-K1細(xì)胞后，EMA陽性區(qū)域熒光信號(hào)增強(qiáng)，且隨著MMC和CP濃度增加熒光信號(hào)增強(qiáng)（見圖1、2）。提示EMA陽性可作為細(xì)胞毒性初步判斷的依據(jù)。

2.4 細(xì)胞周期檢測結(jié)果

流式細(xì)胞儀自動(dòng)化檢測方法可以通過SYTOX Green在FL1通道的熒光信號(hào)面積定性分析化合物對(duì)細(xì)胞周期的影響。圖中為正常細(xì)胞周期信息，靠近坐標(biāo)原點(diǎn)的熒光信號(hào)峰為G1期，強(qiáng)度更大的熒光信號(hào)峰為G2/M期。本試驗(yàn)中，MMC和CP對(duì)細(xì)胞周期的阻滯主要表現(xiàn)在G2/M期，且隨著濃度增加，G2/M期熒光信號(hào)呈增強(qiáng)趨勢（見圖 3、4）。

3 討 論

本試驗(yàn)中，MMC和CP兩個(gè)經(jīng)典的遺傳毒性化合物采用流式細(xì)胞儀檢測得到的結(jié)果均為陽性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9-10，12］。在有/無代謝活化系統(tǒng)的條件下，流式細(xì)胞儀自動(dòng)化檢測方法和人工閱片的方法的Spearman 系數(shù)rs=1.000，相關(guān)性好。因而，本實(shí)驗(yàn)室初步建立了96孔板流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測方法。此方法的優(yōu)點(diǎn)主要包括：①流式細(xì)胞儀檢測可以明顯縮短分析時(shí)間，每個(gè)孔進(jìn)樣檢測的時(shí)間約3 min，比人工閱片的方法快40～100倍；②96孔板流式細(xì)胞術(shù)檢測方法樣品處理簡便，貼壁細(xì)胞樣品處理可直接在孔板中完成而無需消化、離心，傳統(tǒng)人工閱片方法消化、低滲、3次固定及離心操作則耗時(shí)費(fèi)力；③減少了細(xì)胞和待測化合物的使用量，96孔板需要的細(xì)胞數(shù)及化合物用量僅為平皿用量的1/100；④可進(jìn)行高通量的檢測，特別適用于化合物早期遺傳毒性的篩選；⑤EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記可排除凋亡、壞死細(xì)胞碎片對(duì)微核的干擾，依據(jù)EMA陽性率可初步判斷細(xì)胞毒性大小；⑥可以提供細(xì)胞周期信息，定性分析待測化合物對(duì)細(xì)胞周期的影響；⑦計(jì)數(shù)珠用于評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性有助于減少因過度細(xì)胞毒性引起的假陽性結(jié)果。

下一步我們將選擇不同遺傳毒性強(qiáng)度和不同作用機(jī)制的遺傳毒性化合物以及非遺傳毒性的化合物進(jìn)行驗(yàn)證，分析此方法的靈敏度和特異性。此外體外遺傳毒性試驗(yàn)假陽性率高倍受研究者們關(guān)注，過度細(xì)胞毒性、p53基因型、代謝活化系統(tǒng)和細(xì)胞系遺傳穩(wěn)定性等是重要影響因素［13-17］。選擇p53野生型細(xì)胞、接近人代謝活化系統(tǒng)的細(xì)胞及基因型穩(wěn)定的細(xì)胞研究也是我們的努力方向。

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Establishment of flow cytometric in iin viittrro micronucleus assay

OU Hongmei，ZHOU Changhui，TU Honggang，HUANG Pengcheng，CHANG Yan*
（China State Institute of Pharmaceutical Industry， Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry， National Shanghai Center for New Drug Safety Evaluation & Research， Shanghai 201203， China）

目的： 建立96孔板流式細(xì)胞術(shù)體外微核自動(dòng)化檢測的方法，并探討其用于藥物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評(píng)價(jià)的可能性。方法：試驗(yàn)分為+S9短時(shí)處理組（4 h）和-S9持續(xù)處理組（24 h），分別選擇3個(gè)不同濃度的環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C處理CHO-K1細(xì)胞，24 h后收獲細(xì)胞。采用EMA和SYTOX Green雙色標(biāo)記，流式細(xì)胞儀分析96孔板的微核率，并與常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)平皿培養(yǎng)、細(xì)胞分裂阻滯法的雙核微核結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：在有或無S9處理?xiàng)l件下，不同濃度的環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C誘導(dǎo)產(chǎn)生的微核率較溶劑對(duì)照組均顯著增加（P均＜0.05），劑量-效應(yīng)關(guān)系明顯。兩種微核檢測方法的Spearman相關(guān)系數(shù)（rs）為1.000。結(jié)論：流式細(xì)胞術(shù)檢測環(huán)磷酰胺、絲裂霉素C作用于CHO-K1細(xì)胞的微核試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因而本試驗(yàn)初步建立了流式細(xì)胞術(shù)體外微核檢測方法。流式細(xì)胞術(shù)檢測微核的方法與人工閱片的方法相關(guān)性好，提示該方法用于化合物早期遺傳毒性篩選和遺傳毒性評(píng)價(jià)具有良好的前景。

CHO-K1細(xì)胞；體外微核試驗(yàn)；流式細(xì)胞術(shù)；96孔板

OBJECTIVE:Establish the flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells，and explore the possibility of this method for early genetic toxicity screening during drug discovery. MEHTODS：The test included treatment with and without metabolic activation. For the treatment with metabolic activation，CHO-K1 cells were treated with three different concentrations of cyclophosphamide in the S9 mix medium for 4 h，then incubated with S9-free fresh medium for 20 h. For the treatment without metabolic activation，cells were incubated with three different concentrations of mitomycin C continuously for 24 h. In all cases，after a total of 24 h since initiation of the treatment，cells were processed for microscopic scoring or flow cytometric MN analysis. A flow cytometric method for scoring MN used EMA and SYTOX Green to label the cells in 96-well microplate，and then compared with cytokinesis-block micronucleus assay in cell culture disks based on microscopy.RESULTS：Mitomycin C and cyclophosphamide at different concerntrations caused statistically significant and dose-dependent increasess in micronucleus assay. Non-parametric Spearman's coefficients （rs） is 1.000.CONCLUSION：Similar to literature published， mitomycin C and cyclophosphamide induced positive results in flow cytometric based in vitro micronucleus assay. So the method of flow cytometric 96-well microplate-based in vitro micronucleus assay in CHO-K1 cells was established. The concordance between microscopic scoring and flow cytometric was good，therefore this method is promising for screening and evaluating genetic toxicity of chemicals.

CHO-K1 cells；in vitro micronucleus assay；flow cytometric；96-well microplate

R394.6

A

1004-616X（2015）01-0039-05

10.3969/j.issn.1004-616x.2015.01.009

2014-08-13；

2014-12-21

國家十二五重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（2012ZX09505001-003）

作者信息：歐紅梅，E-mail：hongmei_ou@126.com。*通信作者，常 艷，E-mail：y chang@ncdser.com