黃　鑫(綜述)，張敏州(審校)

(廣東省中醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣州 510120)

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盲腸結扎穿孔術——膿毒癥模型研究的金標準

黃鑫(綜述)，張敏州※(審校)

(廣東省中醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣州 510120)

摘要：膿毒癥是一個高發(fā)病率、高病死率的疾病。其發(fā)病特點是全身炎性反應失調引起的免疫功能障礙，因此如何選擇最佳動物模型對研究膿毒癥至關重要。盲腸結扎穿孔術(CLP)是目前研究膿毒癥應用最廣泛、最具代表意義的一種模型，更類似于人類膿毒癥的進展和特點。盡管CLP不能完全復制臨床的膿毒癥，但其仍為膿毒癥發(fā)病機制和防治研究提供了大量有意義的基礎數據。該文對CLP的研究應用予以綜述，以促進實驗研究與臨床試驗間的轉化。

關鍵詞：膿毒癥；盲腸結扎穿孔術；免疫

膿毒癥目前被定義為威脅生命的嚴重宿主炎性反應，并伴隨有器官功能衰竭；是嚴重創(chuàng)傷、燒傷、中暑、休克、大手術后常見的并發(fā)癥，也是導致重癥患者死亡的主要原因之一[1]。隨著社會和醫(yī)療的不斷發(fā)展，膿毒癥依然是一個未被攻克的臨床難題。由于對膿毒癥潛在的發(fā)病機制一直沒有明確，為探討膿毒癥的發(fā)生過程，各種各樣的動物模型應用于實驗研究中，包括血管內輸注活菌模型、毒素/脂多糖攻擊模型、盲腸結扎穿孔術(cecal ligation and puncture,CLP)和升結腸支架置入腹膜炎模型等。其中CLP是目前研究膿毒癥及膿毒性休克應用最廣泛的一種模型[2]，現(xiàn)對CLP模型特點及其研究應用進行綜述。

1CLP模型介紹

CLP模型由Wichterman等[3]改良并推廣應用，至今已有30多年。2009年，Rittirsch等[4]將方法步驟標準化，其CLP造模方法是：氯胺酮 (80～100 mg/kg)和甲苯噻嗪(5～15 mg /kg)腹腔注射麻醉小鼠，然后在其腹壁正中切口，輕輕拉出盲腸，避免碰傷腸系膜血管，并輕輕地擠壓盲腸上端糞便，使盲腸末梢充盈，分離腸系膜表面血管；用無菌4號絲線在盲瓣與盲腸中點進行結扎，并用21 G無菌針頭在結扎部位與盲腸頂端的中點處貫通穿刺盲腸壁，造成穿孔；輕輕擠壓盲腸，擠出少許內容物以確保穿孔通暢，將擠出的內容物擦凈，然后把盲腸推回腹腔，關閉腹腔，逐層縫合；手術后用生理鹽水進行液體復蘇(37 ℃，5 mL/100 g)并應用丁丙諾啡 (0.05 mg/kg)止痛。

1.1CLP模型優(yōu)點與其他模型相比，CLP模型模仿臨床膿毒癥的特點，剖腹術引起組織創(chuàng)傷，遠端盲腸結扎引起組織壞死，穿孔后混有細菌的腸內容物持續(xù)漏入腹腔引起感染，從而誘發(fā)腹膜炎，導致腸道細菌移位，從而激活免疫系統(tǒng)，最終出現(xiàn)呼吸、循環(huán)等系統(tǒng)衰竭，膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征，直至死亡。由于CLP病理過程與臨床癥狀貼近，因此被認為是進行膿毒癥研究的金標準[5]。與其他膿毒癥動物模型相比，CLP模型具有以下優(yōu)點：①步驟簡單，容易復制，適用于大或小的動物；②CLP模型無需接種物，其病原體來自于宿主本身，與臨床上由外傷引發(fā)的腹膜炎相似；③病原體釋放的毒素導致敗血癥和膿毒癥癥狀及體征，在數天后可出現(xiàn)心血管系統(tǒng)衰竭和死亡，與臨床情況貼近；④模型復制后可誘發(fā)動物機體產生大量細胞因子，其細胞因子水平改變的時機及維持時間與臨床患者相似；⑤CLP模型是多種病原微生物感染引發(fā)的膿毒癥模型，可引起與人類膿毒癥相似的早期高動力型(高排低阻)及晚期低動力型(低排高阻)的血流動力學變化，因此其應用廣泛[6]。

1.2CLP模型不足雖然CLP模型與臨床發(fā)生極為貼近，但也有自身的不足，其存在的主要問題是不同研究團隊采用相同實驗方法建立的CLP 模型所得到的病死率存在較大差異；而此模型結果的不均一性直接影響以CLP為基礎的各項研究的可靠性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，影響CLP模型病死率的因素很多，如是否術前禁食、盲腸結扎的長度、穿刺針的粗細和穿孔數量、外科手術切口大小及手術時間、麻醉藥的差異、是否進行了液體復蘇和抗生素的應用、晝夜循環(huán)節(jié)律的影響、動物性別、年齡、品系差異以及宿主反應不同等，其中最主要的問題是CLP模型中感染細菌的量難以控制[7]。由于動物的個體差異，盲腸的大小不一，導致盲腸結扎的長度不同，結扎后的壞死區(qū)域大小不均一，從而引起感染程度的不同；Parker和Watkins[8]認為，盲腸結扎的長度越大，流入腹腔的總糞便量越多，感染越重，病死率越高；而盲腸穿刺針的粗細和穿孔數量一直以來因被認為是影響病死率的主要因素而倍受關注，不同粗細的穿刺針和穿孔數量會使流入腹腔的糞便量(細菌量)不同，這也暗示感染的嚴重程度不同病死率也有差異。且由于個體的差異，一定比例的CLP模型能夠將感染灶局限化，因此不會發(fā)展到膿毒癥[9]。盡管Rittirsch等[4]盡可能地將CLP 模型步驟標準化，但上述問題仍不能解決。因此，模型制備方法的高度一致性與可重復性至關重要，但目前并無此相關報道。

2CLP模型應用

盡管CLP模型有很多不足，但其依然是膿毒癥研究，尤其是免疫系統(tǒng)研究中必不可少的模型之一，對膿毒癥研究的不斷深入起到了至關重要的作用。

2.1免疫激活期膿毒癥初期是免疫激活期，出現(xiàn)非特異免疫系統(tǒng)過度活化，誘發(fā)大量炎性介質包括細胞因子和趨化因子的釋放，從而進一步誘發(fā)失控性炎性反應，而如何識別病原體，建立有效的免疫屏障是關鍵。研究發(fā)現(xiàn)，固有免疫細胞中胚系編碼的模式識別受體可以識別除內毒素外的病原相關分子模式，并通過Toll樣受體信號介導產生各種炎性細胞因子、Ⅰ型干擾素和抗微生物蛋白[10]。文獻報道，膿毒癥主要的促炎因子包括白細胞介素(interleukin，IL)1、IL-2、IL-6、IL-8、高遷移率族蛋白B1、巨噬細胞游走抑制因子、一氧化氮、血小板活化因子、補體C3a和C5a、腫瘤壞死因子和單核細胞趨化因子1等，而且IL-6的高表達與CLP造模后的病死率呈正比[11]。因此，在體內阻斷這些細胞因子已被視為一個新興的治療方案。新近發(fā)現(xiàn)IL-7和IL-17成為膿毒癥中的關鍵細胞因子[12-13]，同時，抗炎因子IL-10及糖皮質激素也參與了此過程[14]，預示著膿毒癥進入免疫抑制期。

2.2免疫抑制期在免疫激活的同時，機體出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為抗炎因子水平顯著上調和特異性免疫系統(tǒng)的功能障礙，導致促炎因子與細胞膜上受體結合受阻、免疫應答反應下調、T細胞反應性低下或無反應。Hotchkiss等[15]發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞凋亡與免疫功能抑制密切相關，抑制淋巴細胞凋亡有助于改善機體免疫功能，進而提高生存率。新近有研究發(fā)現(xiàn)，IL-7可以促進T細胞的活化能力，提高T細胞受體的多樣性，增加細胞黏附分子的表達，降低淋巴細胞的凋亡，從而提高動物的生存率[16-17]。

2.3凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)膿毒癥不僅與炎性通路相關，還會嚴重影響凝血系統(tǒng)[18]和補體系統(tǒng)[19]。凝血系統(tǒng)和補體系統(tǒng)對膿毒癥的發(fā)病過程具有重要影響，兩者與炎性反應相互促進，共同構成膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的關鍵因素[5]。臨床發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者出現(xiàn)活化蛋白C、抗纖維蛋白酶、組織因子等抗凝物質水平降低，導致機體凝血系統(tǒng)變?yōu)榇倌隣顟B(tài)[20]。CLP模型中發(fā)現(xiàn)，給予組織型纖溶酶原激活劑干預后，可明顯改善機體凝血狀態(tài)，并提高動物生存率[21]。凝血系統(tǒng)與炎性反應相互關聯(lián)，炎性因子的大量釋放誘導增加凝血酶表達、降低抗纖維蛋白酶表達、抑制抗凝血酶生成、損傷纖溶系統(tǒng)，影響正常凝血機制[22]。補體的3條活化途徑在膿毒癥中均被不可控地放大，從而導致體內活化的補體水平增高[23-24]。尤其是C5a，有很強的促炎作用，可引起胸腺細胞、腎上腺髓質細胞和心肌細胞的凋亡，因此阻斷C5a成為一種潛在的治療手段[25]。目前研究發(fā)現(xiàn)，C5a的2個不同受體C5aR(CD88)和C5L2(GPR77)均參與膿毒癥的發(fā)病過程，并且這兩者可能相互關聯(lián)[25-26]。

3CLP模型與臨床轉化

雖然CLP模型在病理生理和免疫系統(tǒng)中可闡述膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展，并取得一定研究成果，但這些成果卻不能很好地轉化為臨床應用；一些在動物實驗中顯示出很好療效的藥物，在臨床試驗性治療中并未取得預期的結果，IL-2阻斷劑、類固醇等在臨床試驗中相繼失敗，有的甚至顯示出有害作用[27-28]。動物實驗與臨床試驗出現(xiàn)如此強烈的差異，首先是膿毒癥的發(fā)病機制一直沒有明確，其次CLP模型不能充分模仿出臨床膿毒癥的復雜變化[29]。

3.1膿毒癥致病機制的認識膿毒癥的致病機制一直是大家所關注的焦點。目前得到大家普遍認可的是3個假說，即以免疫系統(tǒng)過度活化誘發(fā)的失控性炎性反應為特征的全身炎性反應綜合征假說；以代償性抗炎反應誘發(fā)的免疫抑制為特征的代償性抗炎反應綜合征假說和混合性拮抗反應綜合征假說[30-32]；且這3個假說已被一一證實[33-34]。事實上，膿毒癥中促炎與抗炎是相互交叉的過程，到底是抗炎在先還是促炎在先是研究者們一直爭議的問題。Cyktor和Tumer[35]研究發(fā)現(xiàn)，無論是原核生物還是真核生物其病原體都能刺激細胞分泌IL-10。Muenzer等[36]觀察到，CLP造模后給予2次感染打擊，IL-10水平異常增高，與病死率呈正比；而IL-10抑制劑AS-101干預后，病死率顯著下降。Huet和Chin-Dusting[37]新近提出一個新的概念，即初始抗炎反應綜合征，機體局部或系統(tǒng)在炎性反應初期出現(xiàn)的抗炎反應；也就是說，膿毒癥早期的抗炎反應被認為是對抗初始抗炎反應，從而引起暴發(fā)性炎性反應。

3.2臨床膿毒癥的復雜性膿毒癥臨床患者的預后受多方面影響，動物模型無法模擬臨床膿毒癥的復雜性，包括性別、年齡、體質量、營養(yǎng)條件、遺傳學、社會因素(吸煙、飲酒、壓力)、環(huán)境因素、病因、治療時間、抗生素應用、支持治療、抗凝、并存疾病等[5]。膿毒癥的致病因素多種多樣，革蘭陰性和革蘭陽性細菌、病毒和真菌感染等均可誘發(fā)，但CLP模型模仿的是臨床穿孔性腹膜炎引發(fā)的膿毒癥，為多種微生物混合的腸道細菌；臨床膿毒癥患者年齡大都在50歲以上，而實驗大鼠的一般年齡是2～3個月，相當于人的10歲，Turnbull等[38]證實了CLP模型中年齡與病死率的相關性；同時發(fā)現(xiàn)，臨床膿毒癥的治療時間都是在發(fā)病后，而實驗室的治療時間大都是在CLP模型前；臨床膿毒癥患者檢測手段多種多樣，而同樣的檢測手段在動物模型中的應用卻少之又少。臨床膿毒癥的復雜性決定了CLP模型的局限性，于是不同的團隊嘗試不同的模型方法進行研究，但上述的這些局限性在其他的膿毒癥動物模型中也普遍存在，因此并未獲得認可的結論。

4小結

盡管膿毒癥的多種動物模型存在諸多局限(包括CLP模型無法完全再現(xiàn)人類膿毒癥的演變過程)，但CLP依然是目前最具代表意義的膿毒癥模型，故仍被認為是膿毒癥的金標準模型。為了改善膿毒癥的治療前景，研究者必須進一步深入探索膿毒癥的免疫與發(fā)病機制，思考如何合理改進動物模型，盡最大可能地模擬臨床膿毒癥的復雜性，以增強模型與臨床的符合性，確定新的治療靶點，尋求更好的膿毒癥防治思路和策略。

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Gold Standard for the Model Research of Cecal Ligation and Puncture-Sepsis

HUANGXin,ZHANGMin-zhou.

(IntensiveCareUnit,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China)

Abstract:Sepsis is a disease of high incidence and high mortality,which is characterized by dysregulated systemic inflammatory responses followed by immunosuppression,so how to choose the best animal model for the study of sepsis is crucial.Sepsis induced by cecal ligation and puncture(CLP) is the most widely used model.Although CLP does not completely reproduce the complexity of human sepsis,the CLP model is one of the best representations of human sepsis which has made important contributions to our knowledge of the inflammation involved in sepsis and to the identification of therapeutic strategies.Here we gathered these data on the CLP-induced sepsis model for a review to narrow the gap between experimental research and clinical trial.

Key words:Sepsis; Cecal ligation and puncture; Immunity

基金項目：廣東省科技廳項目(20110315)；廣州中醫(yī)藥大學創(chuàng)新基金(11CX073)；廣東省中醫(yī)藥局(20121170)；廣東省衛(wèi)生廳(s2012010010397)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.03.004

中圖分類號：R631

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)03-0392-04

收稿日期:2014-04-08修回日期:2014-07-21編輯:伊姍