陳丕庭，馬樹杰，殷培軍,3，鄭偉，馬志卿，2，張興，2

1西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌 712100；

2陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；

3黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266555

植物保護

植物源抗病毒劑VFB-1防治煙草花葉病毒病研究

陳丕庭1，馬樹杰1，殷培軍1,3，鄭偉1，馬志卿1，2，張興1，2

1西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心，陜西楊凌 712100；

2陜西省生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100；

3黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島 266555

以植物源抗病毒劑VFB為基礎(chǔ)，經(jīng)配方改造和工藝改進，優(yōu)化出了植物源抗病毒劑VFB-1。為探究VFB-1對煙草花葉病的防治作用，本研究采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV的體外鈍化、初侵染和復(fù)制增殖抑制活性；采用盆栽法和田間小區(qū)試驗評價了VFB-1對煙草花葉病毒病的預(yù)防及治療效果。結(jié)果表明，VFB-1對煙草花葉病毒(TMV)具有明顯的體外鈍化作用，鈍化30min后，抑制率達82.77%；對TMV的初侵染和復(fù)制增殖具有較好的抑制作用，24 h的抑制率分別達到69.80%和54.07%?盆栽藥效試驗中，VFB-1100倍稀釋液的預(yù)防效果為70.23%，治療效果為35.70%；田間藥效試驗表明，VFB-1對煙草花葉病毒病有較好的預(yù)防和治療作用，其200倍稀釋液藥后21d的預(yù)防效果仍為40%以上，400倍液的預(yù)防效果明顯高于VFB，且與病毒A（20% 嗎啉胍·乙銅WP）相當(dāng)；其200倍液14d的治療效果顯著高于VFB（200倍稀釋液）和病毒A（400倍稀釋液）處理。可見，植物源抗病毒劑VFB-1對TMV具有良好的預(yù)防和治療效果，開發(fā)前景良好?

VFB-1；煙草花葉病毒；抗病毒活性；煙草花葉病；植物源農(nóng)藥

植物病毒病在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重，且難以防治[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國大多數(shù)煙區(qū)煙草花葉病流行年份田間發(fā)病率高達50%以上，嚴(yán)重者絕收[2-3]。由于植物病毒對寄主細(xì)胞具有絕對寄生性，病毒傳播方式具有多樣性，且植物缺乏完整的免疫系統(tǒng)，因而高效抗病毒劑的開發(fā)存在極大困難，至今尚未有理想的化學(xué)防治藥劑[4]。大量研究表明，植物源農(nóng)藥具有安全、作用方式多樣、與環(huán)境相容等優(yōu)點，因此加強植物源抗病毒劑的研究成為新農(nóng)藥開發(fā)及植物病毒病防治的重要工作[5-7]。目前已發(fā)現(xiàn)多種植物提取液具有良好的抗TMV活性[8-12]。

VFB是由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心研制的一種植物源抗病毒劑，前期試驗表明其對煙草、辣椒等多種作物上的多種植物病毒病均具有良好的預(yù)防作用，但治療效果一般[13-17]。李晨等已經(jīng)對VFB的配方及加工工藝進一步改進，藥效有明顯提高，但成本仍然偏高，工藝較為復(fù)雜[18]。在此基礎(chǔ)上，經(jīng)進一步的配方和工藝優(yōu)化，研制出了VFB-1，初步的室內(nèi)試驗表明，該配方抗病毒活性優(yōu)于VFB，但田間效果尚不明確。基于此，本研究以TMV為供試毒源，采用半葉法、盆栽法及田間小區(qū)試驗，較為系統(tǒng)地評價VFB-1對TMV的抑制作用，以期為該藥劑的進一步應(yīng)用提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)?

1 材料與方法

試驗于2012年6月至2013年10月在西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心和河南省澠池縣果園鄉(xiāng)李家村中煙種植基地完成。

1.1 材料

寄主：以心葉煙 (Nicotiana glutinosa L.)為枯斑寄主，以普通煙(Nicotiana tabacum) K326為系統(tǒng)寄主。將煙草種子與一定量基質(zhì)混勻后均勻灑在裝有基質(zhì)的育苗盤，澆水適量，于適宜條件下(溫度22±1℃，光照16h/d，濕度60%)培養(yǎng)，當(dāng)幼苗長至4～6片真葉時供試?

供試毒源：TMV由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院病毒研究室提供，保存于普通煙(N.tabacum)上，參照Gooding等的方法進行提純[19]。TMV接種液由新鮮病葉和 PBS緩沖液 (0.01 mol·L-1，pH 7.2)按1﹕2(W/V)的比例研磨后，用4層紗布過濾待用?

供試藥劑：VFB-1和VFB水劑由西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心提供；20%病毒A可濕性粉劑（20% 嗎啉胍·乙銅WP），由惠州市中迅化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 室內(nèi)生測試驗方法

室內(nèi)生測均采用半葉枯斑法[20]，在22±1℃室溫下進行，以健康、生長旺盛的5～6葉期心葉煙供試。

1.2.1 體外鈍化作用

鈍化試驗中，左半葉接種供試藥劑與病毒等體積混合液，右半葉接種蒸餾水與病毒等體積混合液(對照)。VFB-1、VFB和病毒A均稀釋50倍，鈍化時間分別為0.5、1和2 h，共9個處理。每處理接種6片葉子，重復(fù)3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，計算抑制率?？莅咭种坡拾凑铡?.5”中公式計算。

1.2.2 抑制TMV初侵染和增殖作用

VFB-1和VFB的供試濃度分別為50、100和200倍稀釋液，而以病毒A400倍稀釋液為對照。初侵染試驗中，各處理分別在施藥24h后接種病毒；增殖試驗中，均在接種病毒后施藥。施藥方式為涂抹法，左半葉涂抹供試藥劑，右半葉為清水對照。每處理接種6片葉子，重復(fù)3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，計算抑制率。枯斑抑制率按照“1.5”中公式計算。

1.3 盆栽試驗方法

選擇 5-6 葉期，長勢一致、健壯的普通煙供試。試驗設(shè)預(yù)防組（第3次施藥 24 h后接種 TMV）、治療組（接種 TMV 24 h后施藥 3 次）和對照組（只接種不施藥）。分別用 VFB-1和VFB 100 倍液及病毒A 400倍液噴霧處理，每 5 d 施藥一次，共施藥三次。TMV接種濃度為 1：20(W/V)。施藥結(jié)束后 7d 檢查發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)及防治效果。每處理 60 株煙苗，試驗重復(fù) 3 次。

1.4 田間藥效試驗方法

田間小區(qū)藥效試驗地位于河南省澠池縣果園鄉(xiāng)李家村連續(xù)3年種植煙草、病毒病常年發(fā)生嚴(yán)重的田塊進行，煙草品種為中煙100，煙田肥力較為均勻，煙苗5月3日移栽，生長健壯，長勢均勻，自然發(fā)病。試驗分為預(yù)防試驗和治療試驗。預(yù)防試驗在煙苗移栽后尚未發(fā)病時進行，設(shè)VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液和400倍液3個劑量，常量噴霧處理，以20%的病毒A可濕性粉劑400倍液為對照，并設(shè)清水對照，共7個處理，每處理重復(fù)3次，每隔7d施藥1次， 3次施藥7d后 (7月16日)調(diào)查病情，共調(diào)查3次。治療試驗在煙苗發(fā)病初期時進行，設(shè)VFB-1和VFB的 100倍液、200倍液2個劑量處理，以20%的病毒A可濕性粉劑400倍液為對照，并設(shè)清水對照，共5個處理，每處理重復(fù)3次，施藥前調(diào)查病情指數(shù)，施藥后7天(7月16日)調(diào)查病情，每隔7d施藥1次，共2次。小區(qū)面積為20m2，采用隨機排列，處理間設(shè)立保護行。

田間調(diào)查病情分級標(biāo)準(zhǔn)為：0級，全株無?。?級，心葉明脈或輕微花葉，病株無明顯矮化；3級，1/3葉片花葉但不變形，或病株矮化為正常株高的3/4以上；5級，1/3-1/2葉片花葉，或少數(shù)葉片變形，或主脈變黑，或病株矮化為正常株高2/3-3/4；7級，1/2-2/3葉片花葉，或變形或主側(cè)脈壞死，或病株矮化為正常株高的1/2-2/3；9級，全株葉片花葉，嚴(yán)重變形或壞死，或株矮化為正常株高的1/2以上。

1.5 結(jié)果計算及統(tǒng)計方法

室內(nèi)生測試驗中，統(tǒng)計處理和對照的枯斑數(shù)，計算枯斑抑制率：

枯斑抑制率(%)=(對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù))/對照枯斑數(shù)×100

田間試驗中，調(diào)查各處理的病情，計算病情指數(shù)及防效：

病情指數(shù)=∑(病級數(shù)×病株數(shù))/(最高病級×處理總株數(shù))×100

預(yù)防效果=(對照病指—處理病指)/對照病指×100%

治療效果=[1-(對照區(qū)藥前病指×處理區(qū)藥后病指)/(對照區(qū)藥后病指×處理區(qū)藥前病指)]×100%

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，用單因素方差分析統(tǒng)計各處理平均數(shù)的差異，LSD法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 VFB-1對TMV體外鈍化作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1在心葉煙上對TMV的鈍化作用。結(jié)果（表1）表明，VFB-1對TMV病毒粒子具有強烈的體外鈍化活性，且隨鈍化時間的延長，鈍化效果逐漸增強，50倍稀釋液鈍化5、30和60min后，抑制率分別為79.78%、82.77%和83.40%，均顯著高于相同鈍化時間下對照藥劑病毒A和VFB。

表1 VFB-1對TMV的體外鈍化作用Tab.1 Inactivation of VFB-1 to TMV in N.glutinosa at different treating times in vitro

2.2 VFB-1對TMV初侵染的抑制作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV初侵染的抑制作用，結(jié)果見表2。由表2可看出,VFB-1對TMV初侵染表現(xiàn)出明顯的抑制作用，施藥24h后接種，在50、100和200倍稀釋液處理后，對TMV的抑制率分別達到了69.80%、62.70%和57.85%；隨著VFB-1稀釋倍數(shù)增加，其對TMV初侵染的抑制率有所降低，但抑制率顯著高于同等稀釋倍數(shù)的VFB和對照藥劑病毒A400倍液處理。

表2 VFB-1對TMV初侵染的抑制作用Tab.2 Inhibiting infectivity of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.3 VFB-1對TMV復(fù)制增殖的抑制作用

采用半葉枯斑法測定了VFB-1對TMV增殖的抑制作用，結(jié)果見表3。從表3可以看出，VFB-1對TMV的復(fù)制增殖具有較好的抑制作用。接種24h后施藥，在50、100和200倍劑量下，對TMV的抑制率分別為54.07%、49.21%和45.29%，隨著稀釋倍數(shù)逐漸增大，對TMV的抑制率逐漸降低，但抑制率顯著高于同等稀釋倍數(shù)的VFB和對照藥劑病毒A 400倍液處理。

表3 VFB-1對TMV復(fù)制增殖的抑制作用Tab.3 Inhibiting multiplication of TMV in N.glutinosa by VFB-1

2.4 VFB-1對煙草花葉病毒病的盆栽藥效試驗

用 VFB-1100 倍液和VFB100倍液噴霧處理普通煙，測定其對煙草花葉病毒病的預(yù)防和治療效果。由試驗結(jié)果（表4）可以看出，VFB-1對TMV的侵染表現(xiàn)出較好的預(yù)防作用，防效達到70.23%，顯著高于VFB和對照藥劑病毒A；在治療試驗中，藥效相對一般，防效僅為35.70%，但顯著高于VFB和對照藥劑病毒A處理。

表4 VFB-1 防治煙草花葉病毒病的盆栽試驗結(jié)果Tab.4 Effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in pot e xperiment

2.5 VFB-1防治煙草病毒病的田間藥效試驗結(jié)果

2.5.1 預(yù)防作用

由表5可以看出，VFB-1各濃度處理對煙草病毒病均具有良好的預(yù)防作用，其100倍液對煙草病毒病的效果最好，藥后7d、14d和21d的防效分別達56.03%、55.17%和50.23%，顯著高于對照藥劑病毒A；另外，隨著VFB-1稀釋倍數(shù)的增加，VFB-1對煙草病毒病的預(yù)防作用有所降低，稀釋至400倍時，其防效高于同期病毒A處理（400倍稀釋液）和VFB 400倍液處理。

表5 VFB-1對煙草病毒病的保護作用Tab.5 Protection effect of VFB-1 against tobacco mosaic disease in field trial（Sanmenxia,Henan province,from June to August 2013）

2.5.2 治療作用

VFB-1對煙草病毒病的治療作用測定結(jié)果見表6。由表6可以看出，VFB-1對煙草病毒病表現(xiàn)出較好的治療效果。其中VFB-1100倍液在施藥后7d和14d的治療效果分別達到了41.68%和59.47%；VFB-1200倍液藥后14d的治療效果仍達49.20%，顯著高于同劑量的VFB處理及病毒A 400倍液處理。

表6 VFB-1對煙草病毒病的治療作用Tab.6 Remedial effect of VFB-1against tobacco mosaic disease i n field trial (Sanmenxia,Henan province,from June to August 20 13）

3 討論

3.1 VFB-1對煙草花葉病毒病有較好防效

近年來，生物源抗病毒劑的研發(fā)已成為抗病毒劑開發(fā)中的主流，也有部分產(chǎn)品獲得成功，例如殼寡糖、香菇多糖、寧南霉素等。本研究以植物源抗病毒劑VFB的升級改造產(chǎn)品VFB-1為材料，較為系統(tǒng)地測定了其室內(nèi)外藥效。室內(nèi)生測表明，VFB-1較VFB的抗TMV的活性更強；田間藥效試驗顯示，VFB-1不但對煙草病毒病具有較好的預(yù)防作用，且具有明顯的治療效果，其100倍液施藥7d和14d后的藥效分別達到了41.68%和59.47%，顯著優(yōu)于VFB原配方和病毒A。據(jù)報道，常見生物源抗病毒劑中，8% 寧南霉素1000倍液對煙草病毒病的田間預(yù)防作用約為55%，病毒豐500倍液對煙草病毒病的田間預(yù)防作用約為40%， 氨基寡糖素500倍液對煙草病毒病的田間預(yù)防作用約為35%[21-26]，而這幾種藥劑對煙草病毒病的治療效果均不理想?？梢?，VFB-1對煙草病毒病的田間預(yù)防作用要略高于病毒豐和氨基寡糖素，而弱于寧南霉素，但治療作用明顯好于這三種常見制劑。

另外，VFB-1制劑是以植物材料加工研制而成，包括馬齒莧、甘草等，其劑型也為水劑，不含任何有機溶劑，因此，該藥劑對環(huán)境、人畜應(yīng)十分安全。

綜上所述，VFB具有抗病毒活性高，藥效優(yōu)良，無公害，加工材料成本低，資源豐富，加工工藝簡單等優(yōu)點，符合現(xiàn)代農(nóng)藥發(fā)展方向，具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

3.2 VFB-1制劑的田間應(yīng)用技術(shù)需要進一步研究

科學(xué)的用藥技術(shù)包括施藥時間、施藥方式、施藥劑量、施藥次數(shù)等。本研究中，對VFB-1主要采用常量噴霧法施藥，取得了較好的防治效果，而在以往VFB的試驗中還采用灌根及灌根加噴霧等處理方法[18]。因此，對VFB-1的施藥方式還需要進一步研究。本試驗施藥時間主要在煙苗旺長期和成熟期，而沒有進行返苗期和伸根期的藥劑處理，在返苗期和伸根期施藥是否對煙草病毒病的預(yù)防效果更好，尚需進一步探討。此外，本試驗主要測定了VFB-1對煙草花葉病毒病的預(yù)防和治療效果，前期試驗表明VFB對煙草、辣椒等多種作物上的多種植物病毒病均具有良好的防效[17]，因此，還有必要開展VFB-1防治譜的研究。

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Control effect of phytogenic VFB-Ⅰagainst tobacco mosaic virus disease

CHEN Piting1，ZHENG Wei1，MA Shujie1,2，MA Zhiqing1,2，ZHANG Xing1,2
1 Research &Development Center of Biorational Pesticides,Shaanxi Research Center of Biopesticide Engineering &Technology,Yangling,Shaanxi 712100,China；
2 Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management,Ministry of Education Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling,Shaanxi 712100,China

Effect of VFB-I on tobacco mosaic virus (TMV) was evaluated with anti-TMV activities tested in vitro by local lesion.Protection and treatment efficiencies of VFB-I on TMV were evaluated by pot experiment and field plot trials.Results showed that VFB displayed significant inactivation on TMV with inhibition rate of 82.75% after mixing VFB with TMV for 0.5 h.Infection and replication of TMV to Nicotiana glutinosa were also inhibited by VFB-I,with inhibition rate of 69.80% and 54.06%,respectively.Pot experiment showed that protection efficiency of VFB-Ⅰagainst TMV disease was 70.24% and remedial efficiency was 35.71% by spraying with VFB-Ⅰ diluent of 1:100.In field trials,protection efficiency of VFB-Ⅰdiluent of 1:400 on TMV disease was higher than that of VFB,but equivalent to that of 20% moroxydine+cupric acetate WP at the same concentration.The remedial effect of VFB-Ⅰ(diluent of 1:200)was much stronger than that of 20% moroxydine+cupric acetate WP (diluents of 1:400) and VFB (diluents of 1:200).VFB-Ⅰ showed higher anti-TMV activity indicating that it is effective in controlling TMV disease.

VFB-Ⅰ；TMV； anti-virus activity； tobacco mosaic disease；botanical pesticide

陳丕庭，馬樹杰，殷培軍，等。植物源抗病毒劑VFB-1防治煙草花葉病毒病研究[J].中國煙草學(xué)報，2015,21（3）

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（200903052）

陳丕庭（1987—），碩士研究生，主要研究方向為農(nóng)藥學(xué)，Email：peiting365@163.com

馬志卿（1975—），博士，教授，主要研究方向為生物農(nóng)藥研發(fā)及農(nóng)藥毒理學(xué)，Email: mazhiqing2000@126.com

2014-03-07

: CHEN Piting，ZHENG Wei，MA Shujie,et al.Control effect of phytogenic VFB-Ⅰ against tobacco mosaic virus disease [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)