王浩軍，王芳，姚忠達(dá)，郭東鋒，舒俊生

1 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，合肥市天達(dá)路9號(hào)，230088;

2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥市農(nóng)科南路40號(hào)，230031

利用siRNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)煙草病毒

王浩軍1，王芳2，姚忠達(dá)1，郭東鋒1，舒俊生1

1 安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，合肥市天達(dá)路9號(hào)，230088;

2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，合肥市農(nóng)科南路40號(hào)，230031

植物可以利用小干擾RNA(siRNA)機(jī)制干擾體內(nèi)RNA病毒的增殖，從而獲得對(duì)該病毒的免疫能力。為了快速檢測(cè)田間煙草病毒病種類和發(fā)現(xiàn)煙草新病毒，本文通過第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)煙草的小RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，利用軟件velvet version 1.1.06對(duì)測(cè)得的短序列進(jìn)行組裝，再通過生物信息學(xué)方法將得到的重疊群進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對(duì)尋找其中的病毒序列。研究結(jié)果得出我國安徽皖南煙區(qū)煙草存在PVY、CMV、TMV和TVBMV等RNA病毒。檢測(cè)到3個(gè)重疊群與Potato leafroll virus部分同源，同源性低于90%，疑似一種煙草新病毒。至此建立了檢測(cè)煙草病毒和發(fā)現(xiàn)新病毒的一種新方法，可用于大田煙草病毒的本底調(diào)查。

高通量測(cè)序;小干擾RNA;病毒檢測(cè)

煙草是我國的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，病毒病是煙草生產(chǎn)上的重要病害。常見的煙草病毒主要有馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVMBV）和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）[1]等。此外，近年來在煙草上還檢測(cè)到一些不常見的病毒如 南美紅辣椒脈斑駁病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）[2]、番茄環(huán)紋斑點(diǎn)病毒（Tomato zonate spot virus,ZTSV）[3]和番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）[4]。這些病毒都對(duì)煙草造成嚴(yán)重的危害。調(diào)查煙田已知和未知的病毒，對(duì)了解不同煙區(qū)病毒病情況，防治和控制病毒病具有一定意義。

植物具有siRNA的天然抗病毒機(jī)制，當(dāng)外來的RNA病毒在植物體內(nèi)復(fù)制時(shí)，機(jī)體會(huì)啟動(dòng)該機(jī)制，產(chǎn)生大量針對(duì)入侵病毒的siRNA。siRNA是長為20-25個(gè)核苷酸的小分子RNA，在植物體內(nèi)通過與靶RNA結(jié)合導(dǎo)致靶RNA的降解。植物就是利用這種機(jī)制抵抗病毒侵染[5]。由于siRNA具有分子量小的特點(diǎn)，可以很容易地與細(xì)胞中的mRNA，tRNA，rRNA區(qū)別出來，因此通過分析siRNA尋找動(dòng)植物中的病毒成為一種簡便易行的手段，Wu等人利用這種方法發(fā)現(xiàn)多種果蠅攜帶的新病毒[6]。Ma等利用小RNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了蚊子的DNA病毒[7]。本文利用siRNA高通量測(cè)序及組裝技術(shù)對(duì)采自安徽皖南煙區(qū)的煙草病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，以期探明安徽皖南煙區(qū)煙草病毒病種類。

1 材料與方 法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)病煙草材料采自安徽皖南煙區(qū)。采集煙草樣品主要癥狀為:葉片表現(xiàn)葉脈壞死，花葉，褶皺鼠尾狀，黃斑，壞死斑點(diǎn)，葉片皺縮。大田期樣品采集時(shí)間為2013年6月。采集部位煙葉上部葉，樣品用錫箔紙包裹液氮保存。所采集的樣品混合構(gòu)成一個(gè)小RNA文庫。

1.2 血清學(xué)檢測(cè)

采用購自ADGEN的DAS-ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)病樣進(jìn)行檢測(cè),具體檢測(cè)方法參照說明書?？寡暹x用番茄斑萎病毒(TSWV)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、煙草飾文病毒(TEV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)、煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)和煙草環(huán)斑病毒(TR SV)。樣品采用同一煙區(qū)的混合樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 煙草總 RNA的提取

采用RNAiso Plus，從煙草葉片中提取植物總RNA。液氮研磨1g混合葉片樣品至粉末狀，無明顯的可見顆粒，向研缽中加入3mL RNAiso Plus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，室溫靜置20-30min，直至樣品完全融化，繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀，分裝到三個(gè)2mL的離心管中，室溫靜置5min，12000g，4℃離心5min，吸取上清于新的離心管中，加入200μL氯仿，劇烈震蕩15s，待溶液充分乳化無分相現(xiàn)象后，室溫靜置5min，12000g，4℃離心15min，吸取上清液于新的離心管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒充分混勻，室溫靜置10min，12000g，4℃離心10min取沉淀，離心管中加入1mL75%的乙醇，上下顛倒離心管，12000g，4℃離心5min后，棄去乙醇，室溫干燥沉淀2-5min，加入適量RNase-free水溶解沉淀，于-80℃保存。

1.4 建庫及測(cè)序

純化的RNA用BioAnalyzer 2100和超微量分光光度計(jì)Nanodrop ND-2000進(jìn)行純度評(píng)估和260nm吸光度檢測(cè)。測(cè)序前的RNA樣品用聚乙二醇(PEG8000)沉淀，沉淀的RNA兩端加上接頭，利用加了接頭的小RNA為模板進(jìn)行cDNA合成。合成的cDNA經(jīng)過15個(gè)PCR循環(huán)構(gòu)建成小RNA文庫。文庫測(cè)序依據(jù)邊合成邊測(cè)序的方法，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000。

1.5 樣本病毒分析

去除低質(zhì)量，未插入接頭的讀段（reads），去除帶多聚A（polyA）的數(shù)據(jù)，最后選取不小于18nt的讀段。處理后的序列用序列組裝軟件velvet version 1.1.06進(jìn)行短序列組裝，由于小RNA文庫中序列均較短，所以設(shè)定參數(shù)hash_length 17。組裝的重疊群尋找高度同源序列：首先，用Blastn將組裝的重疊群與核酸數(shù)據(jù)庫nt database比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果中選出每一條序列的比對(duì)結(jié)果中e值最小的結(jié)果，再篩選出這些結(jié)果中比對(duì)序列的覆蓋度（coverage）至少達(dá)到90%且同源性（identity）也至少達(dá)到90%的結(jié)果。組裝的重疊群尋找部分同源序列：將尋找高度同源序列中沒有找到高度同源性的重疊群用Blastx在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫nr database中尋找同源序列，所設(shè)參數(shù)為 -e 1e-3，從每一條重疊群的比對(duì)結(jié)果中選出e值最小的結(jié)果。篩選和已知病毒序列具有同源性的重疊群：從尋找高度同源序列和尋找部分同源序列篩選出的結(jié)果中選出和病毒序列同源的重疊群，這些重疊群必須只和病毒同源，若和非病毒序列也具有同等的同源性，則舍棄。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

用1.1中的煙草樣品，采用TSWV、PVY、CMV、TMV、TEV、TRSV、TVBMV 7個(gè)抗血清進(jìn)行檢測(cè)。樣品與PVY、CMV、TMV和TVBMV呈陽性，樣品與TSWV、TEV和TRSV均呈陰性。

2.2 小 RNA高通量測(cè)序分析

安徽皖南煙區(qū)煙草樣本經(jīng)RNA提取，小RNA分離，純化和測(cè)序處理，處理讀段為20405970個(gè)，共組裝成10004條重疊群（contig）。小RNA文庫序列長度分布主要集中在21 nt，22 nt和24 nt (圖1)，實(shí)際情況中植物miRNA，siRNA的長度也主要集中在這三種長度，因此說明了煙草樣本建庫的質(zhì)量高，符合實(shí)際情況。

圖1 安徽煙草文庫小 RNA測(cè)序reads長度分布Fig.1 Reads length distribution of small RNA from tobacco libr ary of Anhui province

2.3 煙草病毒檢測(cè)結(jié)果

所得序列用序列組裝軟件Velvet version 1.1.06進(jìn)行短序列組裝，組裝的重疊群尋找高度同源序列（同源性大于90%）和部分同源序列（同源性低于90%），從所得序列中篩選與病毒同源的重疊群比對(duì)結(jié)果如表1。

表1 安徽煙草文庫病毒檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Virus detection results from tobacco library of Anhui

從病毒檢測(cè)結(jié)果中我們可以看出，文庫中檢測(cè)到 了 PVY、CMV、TMV、TVBMV、TuYV、BrYV和PLRV 7種病毒。其中PVY同源重疊群數(shù)目最高為732，其次檢測(cè)到了TMV、CMV和TVBMV同源重疊群數(shù)分別為74、492和122，這4種病毒檢測(cè)結(jié)果同常規(guī)ELISA檢測(cè)結(jié)果相符（數(shù)據(jù)未列出）。小RNA文庫還檢測(cè)到了蕓薹黃化病毒（Brassica yellows virus，BrYV）和蕪菁黃化病毒（Turnip yellows virus，TuYV），這兩種病毒同屬于馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus)，黃癥病毒科(Luteoviridae)，測(cè)序結(jié)果需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證才能明確所采集的樣品里是否含有這兩種病毒。在樣本中還檢測(cè)到了3個(gè)重疊群與Potato leafroll virus部分同源的病毒（圖2），3個(gè)重疊群與已經(jīng)報(bào)道的Potato leafroll virus同源性最高，但是低于90%，這可能是檢測(cè)到的新病毒。

圖2 新病毒與Potato leafroll virus比對(duì)結(jié)果Fig.2 Comparison between new virus and Potato leafroll virus

2.4 部分同源小 RNA的RT-PCR驗(yàn)證

采用RT-PCR方法對(duì)測(cè)序并且拼接的與Potato leafroll virus同源的重疊群進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增三個(gè)重疊群片段。RT-PCR的結(jié)果（圖3）得到了目的條帶，這充分說明了該新病毒在煙草里確實(shí)存在。

圖3 樣本中測(cè)序拼接的與 Potato leafroll virus部分同源重疊群的RT-PCR驗(yàn)證Fig.3 RT-PCR verification of sequencing contigs in samples homologous with Potato leafroll virus

3 結(jié)論與討論

本研究利用小RNA測(cè)序及組裝技術(shù)發(fā)現(xiàn)安徽皖南煙區(qū)存在PVY、TMV、CMV、TVBMV、BrYV、TuYV以及一種與Potato leafroll virus部分同源的新病毒。其中PVY、TMV、CMV和TVBMV與酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)結(jié)果一致，證明所采集的樣品中確實(shí)含有PVY、TMV、CMV和TVBMV。BrYV、TuYV需進(jìn)行進(jìn)一步RT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證是否含有這兩種病毒。發(fā)現(xiàn)的一種新病毒，其同源性與Potato leafroll virus最高，但低于90%。

常規(guī)的病毒檢測(cè)方法主要有電鏡法，酶聯(lián)免疫法（ELISA），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR），這些方法在病毒檢測(cè)和新病毒的發(fā)現(xiàn)中存在一定的缺陷，檢測(cè)病毒的范圍也比較固定，對(duì)于新病毒的發(fā)現(xiàn)較困難，如ELISA檢測(cè)的陽性反應(yīng)毒原種類只能與使用的抗血清種類一致，可能出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，從而對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響；RT-PCR法檢測(cè)病毒需要根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，使得該方法只能對(duì)已知的病毒進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于新病毒的發(fā)現(xiàn)較困難。RNA沉默是植物抗病毒的一種機(jī)制。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞后，RNA病毒的基因組復(fù)制中間物或DNA病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物間會(huì)形成雙鏈RNA(dsRNA)中間體，這些病毒的dsRNA會(huì)被細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶Dicer識(shí)別并產(chǎn)生病毒的siRNA。本研究利用這種植物抗病毒的機(jī)制對(duì)這些小干擾RNA進(jìn)行高通量測(cè)序，這些小干擾RNA之間存在相互重疊序列，并且能夠被組裝成較長的重疊群。因此從病患的植物組織樣本中提取出RNA，通過篩選，建立小RNA文庫，然后對(duì)小RNA進(jìn)行測(cè)序，并組裝總小RNA來檢測(cè)病毒和發(fā)現(xiàn)新病毒。本研究是直接對(duì)樣本中病毒由于復(fù)制或轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的siRNA進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析，不需要對(duì)樣本中病毒進(jìn)行富集和純化，能同時(shí)鑒定樣本中存在的所有的病毒。Wu等人利用這種方法發(fā)現(xiàn)多種果蠅攜帶的新病毒[6]。我們用此方法發(fā)現(xiàn)了一種新病毒，其同源性與Potato leafroll virus最高，但低于90%，新病毒基因組序列獲得及病毒特性有待進(jìn)一步的研究。

[1] 高瑞.煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及其在交叉保護(hù)、外源蛋白表達(dá)及VIGS中的應(yīng)用[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文，2012.

[2]Ding M,Yang C,Zhang L,et al.Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Nicotiana tabacum in Yunnan,China [J].Plant Disease,2011,95(3): 357.

[3] Cai JH,Qin BX,Wei XP,et al.Molecular Identification and Characterization of Tomato zonate spot virus in Tobacco in Guangxi,China [J].Plant Disease,2011,95(11): 1483.

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Detection of tobacco virus by siRNA high-throughput sequencing

WANG Haojun1，WANG Fang2，YAO Zhongda1，GUO Dongfeng1，SHU Junsheng1
1 Technology Center,Anhui Cigarette Industrial Co.Ltd.,Hefei 230088,China；
2 Tobacco Research Institute,Anhui Academy of Agricultural Sciences,Hefei 230031,China

Quick detection of tobacco virus strains and identification of new virus were achieved through 2ndgeneration sequencing technique to perform high throughput sequencing of tobacco siRNA and then screening for RNA virus sequences with bioinformatics methods.Results showed that PVY,CMV,TMV,TVBMV and other virus genomic information were detected in southern part of Anhui tobacco growing areas.Three contigs were identified as partly homologous with Potato leafroll virus,which might be a novel tobacco virus.This research established a new strategy to determine naturally occurred RNA viruses and novel virus in tobacco,and could be applied to virus surveillance in tobacco.

high throughput sequencing;small interference RNA;virus detection

王浩軍，王芳，姚忠達(dá),等.利用siRNA高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)煙草病毒[J].中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21（3）

安徽中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目“皖南煙葉烘烤工藝優(yōu)化與研究”（項(xiàng)目編號(hào)：2013132）安徽省煙草公司科技攻關(guān)項(xiàng)目“安徽省煙草有害生物調(diào)查研究”（項(xiàng)目編號(hào)：20100551005）

王浩軍(1981—)，碩士，農(nóng)藝師，主要從事煙葉原料研究工作，Email: ycswhj0721@126.com

舒俊生（1975—），博士，研究員，主要從事產(chǎn)品開發(fā)和煙葉原料研究管理工作，Email: shujusheng1975@yahoo.cn

2014-02-04

: WANG Haojun,WANG Fang,YAO Zhongda,et al.Detection of tobacco virus by siRNA high－throughput sequencing [J].Acta Tabacaria Sinica,2015,21(3)