王瑩瑩，劉文娜，魏 萍，王子敬，張 萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

嗜酸乳桿菌胞外多糖對(duì)TGEV感染ST細(xì)胞分泌IFN-γIL-6 IL-8的影響

王瑩瑩，劉文娜，魏 萍，王子敬，張 萍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為研究抗病毒嗜酸乳桿菌菌株的細(xì)胞機(jī)制，利用嗜酸乳桿菌胞外多糖（EPS）作用于豬睪丸細(xì)胞（ST），以MTT法檢測(cè)其是否抑制豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）感染，并觀察IFN-γ、IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)分為4組，分別是正常細(xì)胞對(duì)照組（Control組）、TGEV感染組（TGEV組）、EPS預(yù)處理感染TGEV組（EPS+TGEV）組和胞外多糖組（EPS組），在2、4、6、12、24 h時(shí)采集細(xì)胞樣品，通過(guò)熒光定量PCR方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞中IFN-γ、IL-6、IL-8 mRNA的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPS具有抑制TGEV感染ST細(xì)胞的效應(yīng)；EPS組、TGEV組和EPS+TGEV組IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表達(dá)量較Control組比都相對(duì)增加，三種細(xì)胞因子隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)出先快速增加后減少回歸到正常水平的趨勢(shì)。EPS+TGEV組在感染2 h時(shí)IL-8mRNA表達(dá)量達(dá)到最大值，4 h時(shí)IL-6、IFN-γmRNA表達(dá)量達(dá)到最大值，且均出現(xiàn)了疊加效應(yīng)，相比正常細(xì)胞對(duì)照組差異極顯著（P＜0.001）。結(jié)果表明，EPS對(duì)TGEV感染ST細(xì)胞有一定的抑制作用，提高了抗TGEV感染初期IFN-γ、IL-6、IL-8mRNA表達(dá)水平。

嗜酸乳桿菌胞外多糖；TGEV；ST細(xì)胞；細(xì)胞因子

大量研究表明，某些益生菌胞外多糖安全無(wú)毒，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降膽固醇、抗氧化等作用[1]。也有報(bào)道某些胞外多糖具有抗病毒作用。例如，紫球藻胞外多糖在體外具有抗乙肝病毒作用[2]。嗜酸乳桿菌胞外多糖是嗜酸乳桿菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中形成的位于細(xì)胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖。盡管對(duì)嗜酸乳桿菌胞外多糖的免疫調(diào)節(jié)研究很多，但是關(guān)于它的抗病毒研究甚少，尤其是抗豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）。TGEV可引起豬傳染性胃腸炎，該病是豬的一種高度接觸性和急性傳染病，致死率很高，對(duì)于該病的防治極其重要。

病毒感染細(xì)胞會(huì)引起一系列的反應(yīng)，細(xì)胞因

子在抵抗病毒感染的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。IL-6是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的多效性細(xì)胞因子，刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答[4]。IL-8是一種重要的趨化分子，能夠招募和激活周?chē)木奘杉?xì)胞、淋巴細(xì)胞等。IFN-γ具有廣譜抗病毒活性，可以抑制病毒感染過(guò)程中蛋白質(zhì)的復(fù)制。

本試驗(yàn)通過(guò)評(píng)價(jià)TGEV感染ST細(xì)胞中IL-6、IL-8、IFN-γ表達(dá)量的變化經(jīng)EPS對(duì)ST細(xì)胞處理前后的變化規(guī)律，進(jìn)一步闡明嗜酸乳桿菌胞外多糖在抗病毒過(guò)程中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 TGEV TO163株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉長(zhǎng)明研究員惠贈(zèng)；嗜酸乳桿菌由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定保存；ST細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；SYBR?qPCR Mix試劑盒，購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司；HiScript?1st Strand cDNA Synthesis kit，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；噻唑蘭（MTT），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；熒光定量PCR儀ABI7500等。

1.2 方法

1.2.1 EPS的粗提取 在MRS液體培養(yǎng)基中接種試驗(yàn)菌種，37℃厭氧培養(yǎng)18～24 h。菌上清液離心、除蛋白、醇沉獲得粗多糖溶液[5]。

1.2.2 EPS的最大無(wú)毒劑量 采用MTT法[6]測(cè)定。

1.2.3 EPS的抗病毒效果測(cè)定 使用已過(guò)濾除菌最大無(wú)毒劑量的EPS與100TCID50/0.1 mL TGEV（TCID50：10-5.84）等體積加入長(zhǎng)成單層細(xì)胞的96孔板中，采用MTT法測(cè)定[7]。

病毒抑制率=（胞外多糖預(yù)處理組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）/（細(xì)胞對(duì)照組平均OD值-病毒對(duì)照組平均OD值）×100%。

1.2.4 TGEV感染ST和試驗(yàn)分組 ST細(xì)胞以2.0×105個(gè)/mL的密度接入6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后待用。實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、TGEV感染組、EPS預(yù)處理感染TGEV組、EPS對(duì)照組。EPS作用細(xì)胞2 h后，棄去上清，D-hanks洗3遍，加入TGEV，作用1 h，去掉吸附液，加入DMEM細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在病毒感染細(xì)胞2、4、6、12、24 h后，棄上清，PBS洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，直接提取細(xì)胞的RNA或放-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中豬的IL-6、IL-8、IFN-γ基因及參考基因β-actin的序列，設(shè)計(jì)特異引物并合成（見(jiàn)表1）。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 按照Fast200試劑盒提取細(xì)胞RNA，以RNA為模板，按照HiScript?1st Strand cDNA Synthesis kit反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆?。?duì)目的及內(nèi)參基因進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，與pMD18-T載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5-α，基因克隆，提取質(zhì)粒，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，提取的質(zhì)粒10倍倍比稀釋10個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)平行，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 按SYBR?qPCRMix試劑盒說(shuō)明，建立20 uL實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，β-actin、IL-6、IL-8、IFN-γ退火溫度分別為60℃、60℃、55℃、59℃，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min，95℃變性15 s，退火30 s，72℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。以稀釋好的質(zhì)粒為模板，PCR儀檢測(cè)后，根據(jù)Ct值，取5個(gè)點(diǎn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 將不同處理組不同時(shí)間點(diǎn)的目的及內(nèi)參基因以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，反應(yīng)條件同上。

2 結(jié)果

2.1 EPS的最大無(wú)毒劑量 EPS劑量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在劑量低于原劑量10-3時(shí)細(xì)胞存活率與空白組接近。確定最大無(wú)毒劑量為10-3稀釋度。

2.2 EPS的抗病毒效果測(cè)定 MTT法結(jié)果顯示，EPS的病毒抑制率為45.65%（見(jiàn)表2）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備 內(nèi)參與目的基因PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增產(chǎn)物（見(jiàn)圖1）。序列測(cè)定證實(shí)成功構(gòu)建了質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

表2 OD490結(jié)果

圖1 內(nèi)參及目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（M：Marker；-：陰性對(duì)照；A：β-actin；B：IL-6；C：IL-8；D：IFN-γ）

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)Ct值儀器制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線（見(jiàn)圖2）、熔解曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98（見(jiàn)圖3）。熔解曲線表明，4種分子均出現(xiàn)特異性單峰（見(jiàn)圖4）。

2.5 目的基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測(cè) TGEV組、EPS+TGEV組、EPS組在作用初期均能刺激IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)的增加且EPS+ TGEV組出現(xiàn)了疊加效應(yīng)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，基因表達(dá)回歸到正常水平。TGEV組在4 h時(shí)IL-6和IL-8基因表達(dá)達(dá)到最大值，6 h時(shí)IFN-γ達(dá)到最大值；EPS組在2 h時(shí)IL-6達(dá)到最大值，4 h時(shí)IL-8達(dá)到最大值，6 h時(shí)IFN-γ達(dá)到最大值；EPS+TGEV組在2 h時(shí)IL-8達(dá)到最大值，4 h時(shí)IL-6、IFN-γ達(dá)到最大值（見(jiàn)圖5）。

3 討論與結(jié)論

圖2 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖3 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 A：β-actin、B：IL-6、C：IL-8、D：IFN-γ實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)不同處理組IL-6、IL-8、IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量的變化

已經(jīng)證明嗜酸乳桿菌及其培養(yǎng)上清均具有抗病毒作用[8]。但培養(yǎng)上清里具體是哪1種物質(zhì)起到了抗病毒作用尚未解決。本試驗(yàn)我們粗提了1株嗜酸乳桿菌的胞外多糖，并測(cè)定了EPS的最大無(wú)毒劑量，以該劑量作用ST細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)提取的EPS具有一定的抗TGEV的作用。熒光定量PCR結(jié)果通過(guò)雙ΔΔCt法分析表明，TGEV和胞外多糖都可以增加ST細(xì)胞IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表達(dá)，不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量不同。EPS＋TGEV組在作用ST細(xì)胞初期可以明顯增加IL-6、IL-8、IFN-γ mRNA的表達(dá)，出現(xiàn)疊加效應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞的免疫活性，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGEV的抵抗力。IL-6、IL-8、IFN-γ隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量均趨向于正常細(xì)胞對(duì)照組，表明EPS只是暫時(shí)性地誘導(dǎo)3種細(xì)胞因子的表達(dá)，這使EPS既可以增強(qiáng)細(xì)胞的免疫功能，又不會(huì)引起免疫過(guò)度，造成損害。細(xì)胞抵抗病毒感染是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，后續(xù)我們將對(duì)該胞外多糖抗病毒活性和抗病毒機(jī)制做更深入的研究。

結(jié)論：EPS具有一定的抗TGEV能力，在作用ST細(xì)胞初期增加IL-6、IL-8、IFN-γmRNA的表達(dá)，刺激細(xì)胞的免疫，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGEV的抵抗力。

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Expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells infected w ith TGEV and on the intervention of Lactobacillus acidophilus extracellular polysaccharides

WANG Ying-ying，LIUWen-na，WEIPing，WANG Zi-jing，ZHANG Ping
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

To study the antiviralmechanism of Lactobacillus acidophilus，we treated ST cellswith EPS.MTT assay was used to verify EPSanti-TGEV effect.Detection of the expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 were performed.The studywere divided into four groups：control group，TGEV group，EPSwith TGEV group，and EPSgroup.We collect the cells at 2 h，4 h，6 h，12 h，and 24 h after cellswere treated differently，and then analyzed themRNA expression of IFN-γ，IL-6，and IL-8 in ST cells at different time points and different treatmentgroups by Real-time PCR.Itwas found that EPSeinhibited TGEV infection in ST cells.IFN-γ，IL-6，and IL-8mRNA expressions in EPSgroup，TGEV group，and EPS+TGEV group were relatively higher than those in the control group.With the extension of time，themRNA expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8 all showed a trend：first increase，then a decrease，and back to normal levels.In EPS+TGEV group，themRNA expression of IL-8 reached its peak at 2 h，and IFN-γ and IL-6 reached theirmaximum at 4 h.Our data show that EPS can enhance the ability of ST to inhibit TGEV by the increased expressions of IFN-γ，IL-6，and IL-8.

EPS；TGEV；ST cells；cytokines

WEIPing

Q939.11+7

A

0529-6005（2015）11-0045-04

2015-01-27

黑龍江省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（12521z001）；哈爾濱科技局項(xiàng)目（2014RFXGJ096）

王瑩瑩（1988-），女，碩士生，研究方向?yàn)橐嫔关i胃腸道病毒，E-mail：825365352@qq.com

魏萍，E-mail：weiiping@163.com