張夢云，楊曉歐，彭玉娟，馮翔宇，李秀華

基礎(chǔ)與實驗研究

雷米普利與曲美他嗪對慢性心力衰竭大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及細(xì)胞色素C的影響

張夢云，楊曉歐，彭玉娟，馮翔宇，李秀華

目的： 探討雷米普利與曲美他嗪單用及聯(lián)合應(yīng)用對慢性心力衰竭（CHF）大鼠腎臟細(xì)胞凋亡及細(xì)胞色素C（Cyt-C）表達(dá)的影響。

方法： 采用腎上腹主動脈縮窄術(shù)復(fù)制CHF模型，將50只雄性Wistar 大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組（雷米普利+曲美他嗪），每組10只。利用TUNEL法檢測腎小管上皮細(xì)胞凋亡；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測Cyt-C mRNA 含量以及Western Blot法檢測腎臟細(xì)胞Cyt-C蛋白表達(dá)水平。

結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）、Cyt-C mRNA含量及蛋白表達(dá)量均顯著增加（P＜0.01），與模型組比較，雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組的腎小管AI[（20.02±1.14）%、（20.10±1.20）%、（14.27±1.40）% vs（ 40.82±1.31）%]、Cyt-C mRNA表達(dá)量 （ 0.54±0.06、0.56±0.05、0.44±0.04 vs 0.89±0.03）及蛋白表達(dá)水平顯著降低（1.50±0.11、1.58±0.12、0.75±0.06 vs 2.53±0.10），且以聯(lián)合用藥組降低最明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜O.01）。

結(jié)論：雷米普利與曲美他嗪均可抑制腎臟細(xì)胞凋亡，有效改善腎臟功能，聯(lián)合用藥對細(xì)胞凋亡的抑制作用優(yōu)于單一用藥。

雷米普利；曲美他嗪；心力衰竭；細(xì)胞凋亡

Objective: To explore the effects of ramipril, trimetazidine and the combination of ramipril and trimetazidine on renal cell apoptosis index (AI) and cytochrome C (Cyt-C) expression in experimental rats with chronic heart failure (CHF).

Methods: CHF model was established by partially banding of abdominal aorta superior to renal artery in experimental rats. A total of 50 male Wistar rats were randomly divided into 5 groups: Sham operation group, Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination (ramipril and trimetazidine) group. n=10 in each group. Renal tubular cell AI was examined by TUNEL method, mRNA and protein expressions of Cyt-C were detected by RT-PCR and Western Blot analysis in each group respectively.

Results: Compared with Sham operation group, Model group had increased AI of renal tubular cells, increased mRNA and protein expressions of Cyt-C, P＜0.01. Compared with Model group, Ramipril group, Trimetazidine group and Combination group showed decreased AI of renal tubular cells (20.02 ± 1.14) %, (20.10 ± 1.2) % and (14.27 ± 1.40) % vs ( 40.82 ± 1.31) %; reduced Cyt-C mRNA expression (0.54 ± 0.06), ( 0.56 ± 0.05) and (0.44 ± 0.04) vs (0.89 ± 0.03); reduced Cyt-C protein expression (1.50 ± 0.11), (1.58 ± 0.12) and (0.75 ± 0.06) vs (2.53 ± 0.10); the most reduction was obtain by Combination group, all P＜0.01.

Conclusion: Ramipril and trimetazidine can inhibit renal cell apoptosis and effectively improve the renal function in CHFrats. Combined medication is better than either of them alone.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1208.)

近年來，隨著慢性心力衰竭（CHF）發(fā)病率和死亡率的上升，腎功能不全發(fā)病率也逐年增高，并且腎功能損害是影響CHF患者病死率上升的獨立因素。線粒體外膜通透性的改變在細(xì)胞凋亡中扮演著非常重要的角色，通透性的改變導(dǎo)致凋亡蛋白細(xì)胞色素C(Cyt-C)釋放至胞漿，激活下游的caspase酶，引起細(xì)胞凋亡發(fā)生[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI )類藥物——雷米普利（RAM）最初僅用于治療高血壓，但臨床研究發(fā)現(xiàn)有更多臨床適應(yīng)癥：腎臟疾病、CHF和心血管疾病預(yù)防。曲美他嗪（TMZ）屬于哌嗪類衍生物藥物，是線粒體酶一長鏈3-酮酰輔酶A硫解酶(3-KAT)抑制劑，具有優(yōu)化細(xì)胞能量代謝，減輕氧化應(yīng)激，抑制活性氧自由基生成與釋放，減少胞膜脂質(zhì)氧化反應(yīng)，在抑制細(xì)胞凋亡方面有一定作用[2]。

本實驗通過觀察CHF大鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡情況及Cyt-C的表達(dá)，以探索兩種藥物在治療CHF引起的腎臟損害療效方面是否相似，以及聯(lián)合用藥的療效是否更佳。

1　材料與方法

材料與試劑 :2014-01至2014-10選擇50只清潔級雄性Wistar大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號：2009-0004）。鹽酸曲美他嗪（瑞陽制藥有限公司）；雷米普利（昆山龍燈瑞迪制藥有限公司）；TUNEL試劑盒[美國羅氏（Roche）公司]; Cyt-C引物（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Trizol(美國Invitrogen公司)；Cyt-C兔抗多克隆抗體（武漢博士得公司）；組織裂解液（貝博科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；Super ECL Plus 超敏發(fā)光液（美國Thermo公司）。

方法:（1）動物模型的建立、分組 ： 全部大鼠經(jīng)1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機抽取10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組大鼠只分離腹主動脈，不予結(jié)扎，其余大鼠均采用腎上腹主動脈縮窄術(shù)復(fù)制CHF模型[3]。將造模成功的Wistar大鼠隨機分為模型組、雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組（雷米普利＋曲美他嗪），每組各10只。術(shù)后大鼠給予20萬U青霉素連續(xù)3 d腹腔注射，并常規(guī)喂養(yǎng)4周，大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸和心跳加快、反應(yīng)遲鈍、食欲減退等表現(xiàn)。經(jīng)血流動力學(xué)參數(shù)檢測：左心室舒張末壓（IVEDP）≥15 mm Hg（1 mmHg＝0.133 kPa）標(biāo)志CHF模型復(fù)制成功。雷米普利組給予雷米普利1 mg/（kg·d），曲美他嗪組給予曲美他嗪10 mg/（kg·d），聯(lián)合用藥組給予雷米普利1mg/（kg·d）＋曲美他嗪10 mg/（kg·d），均灌胃給藥4周，假手術(shù)組及模型組給予等量生理鹽水灌胃相同時間[4]。（2）細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的檢測：采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL法)檢測腎臟細(xì)胞凋亡情況，石蠟組織切片脫蠟至水，采用PBS緩沖液(濃度為0.01 M，由90 g Nacl、29 g Na2HPO4·12 H2O和2.9 g NaH2PO4·2 H2O溶于1000 ml蒸餾水中，調(diào)PH值至7.2～7.4)洗5 min，加入胰蛋白酶去除組織蛋白，PBS緩沖液洗10 min，玻片干后滴加50 μl由50 μl脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）和450 μl熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）混合的反應(yīng)液，陰性對照僅加50 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液，37℃反應(yīng)1 h，采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察凋亡情況并計數(shù)，被激發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞核為陽性細(xì)胞核，每個標(biāo)本隨機選取10個視野觀察，分別對細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞凋亡核數(shù)進(jìn)行計數(shù)并求其平均值，通過公式AI=凋亡細(xì)胞核數(shù)/總細(xì)胞核數(shù)×100%，計算腎臟AI。（3）RT-PCR檢測Cyt-C mRNA表達(dá)：將新鮮腎臟組織從-80℃取出置于冰上解凍，按100 mg組織中加1 ml Trizol比例在勻漿器中進(jìn)行研磨，離心，加氯仿、異丙醇和焦炭酸二乙酯（DEPC）水，使用紫外分光光度計法對提取的總RNA的純度和濃度進(jìn)行測量。Cyt-C的引物序列，上游引物：5’-CCTTTGTGGTGTTGACCAGC-3’；下游引物：5’-CCATGGAGGTTTGGTCCAGT-3’,擴(kuò)增片段為140 bp，退火溫度為50.5℃；β-肌動蛋白(β-actin)引物作為內(nèi)參照，上游引物：5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’；下游引物：5’-CATCTGCTGGAAGGTGGACA -3’，擴(kuò)增片段為452 bp，退火溫度為57℃。使用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物電泳，使用Gel Plus統(tǒng)計軟件進(jìn)行定量分析，以各組Cyt-C吸光度（A）與其對應(yīng)的內(nèi)參照β-actin(A)的比值表示目的基因表達(dá)水平。（4）蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）法檢測Cyt-C蛋白:按照組織裂解液與蛋白定量試劑盒說明書準(zhǔn)確提取各組大鼠腎臟總蛋白并測量蛋白濃度[5]，在95℃的水浴鍋中將與Buffer按比例混勻的蛋白煮5 min變性，用20 μg質(zhì)量上樣，Cyt-C一抗?jié)舛葹?：200，二抗?jié)舛葹?：2000，β-actin的一抗?jié)舛葹?：1000，二抗?jié)舛葹?：2000，采用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)進(jìn)行檢測，顯影。將膠片進(jìn)行掃描處理，采用Gel Plus凝膠分析軟件對顯影條帶進(jìn)行分析，測定蛋白條帶的吸光度值，以目的條帶與內(nèi)參照條帶的吸光度的比值進(jìn)行各組目的蛋白表達(dá)含量的比較。

2　結(jié)果

各組大鼠腎臟AI：圖中綠色熒光的細(xì)胞核為凋亡細(xì)胞核，綠色熒光細(xì)胞核越多說明細(xì)胞凋亡的越多。假手術(shù)組幾乎不存在凋亡細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，模型組中凋亡的細(xì)胞數(shù)顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，聯(lián)合用藥組降低最顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖1，表1）。

圖1　TUNEI法檢測各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的變化 (×200)

表1　各組大鼠腎臟AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表達(dá)的比較

表1　各組大鼠腎臟AI、Cyt-C mRNA及Cyt-C蛋白表達(dá)的比較

注：Cyt-C mRNA表達(dá)水平為各組大鼠Cyt-C mRNA與相應(yīng)β-actin吸光度的比值；Cyt-C蛋白表達(dá)水平為各組大鼠Cyt-C蛋白與相應(yīng)β-actin吸光度的比值；AI:細(xì)胞凋亡指數(shù)；Cyt-C：細(xì)胞色素C；β-actin：β-肌動蛋白。與假手術(shù)組相比*P＜0.01;與模型組相比△P＜0.01;與雷米普利組相比▲P＜0.01;與曲美他嗪組相比#P＜0.01

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各組大鼠腎臟組織Cyt-C mRNA表達(dá):與假手術(shù)組比較:模型組Cyt-C mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較：雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組Cyt-C mRNA表達(dá)均有所降低，以聯(lián)合用藥組下降最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，表1）。

各組大鼠腎臟組織Cyt-C蛋白表達(dá)的比較：與假手術(shù)組比較：模型組Cyt-C蛋白平均吸光度值明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，雷米普利組、曲美他嗪組和聯(lián)合用藥組Cyt-C蛋白平均吸光度值均降低，其中以聯(lián)合用藥組降低最顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），雷米普利組與曲美他嗪組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖3，表1）。

圖2　RT-PCR法檢測各組大鼠腎組織Cyt-C mRNA表達(dá)

圖3　蛋白印跡檢測各組大鼠腎組織Cyt-C蛋白的表達(dá)

3　討論

心臟與腎臟擁有很多相似病理作用機制且二者關(guān)系十分密切，因此CHF常常伴有腎臟功能和結(jié)構(gòu)的損害，并且還進(jìn)一步加重心功能的惡化[6]。有研究表明腎臟在CHF早期可能存在腎小管細(xì)胞凋亡。CHF時由于腎臟灌注不足而處于缺血狀態(tài)，能量代謝發(fā)生障礙，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強、氧自由基生成增多和線粒體外膜受損是細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素[7]。

內(nèi)源性線粒體凋亡途徑在腎臟疾病中發(fā)揮十分重要作用，細(xì)胞的丟失是腎功能不全發(fā)生的一個重要病理生理基礎(chǔ)[8]。線粒體在缺血缺氧、氧化應(yīng)激、細(xì)胞鈣超載等病理條件下，線粒體腫脹，外膜結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開放，線粒體Cyt-C釋放至胞漿[1,9]。Cyt-C定位于線粒體內(nèi)膜上，為線粒體呼吸鏈的重要組成部分，線粒體膜間隙內(nèi)缺乏Cyt-C會中斷呼吸鏈的電子傳遞，ATP生成減少，能量缺失也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

國外有研究表明，氧化應(yīng)激是腎臟疾病重要的病理生理機制，應(yīng)用抗氧化劑對于腎臟疾病的治療是有效的[10]。雷米普利屬于ACEI類藥物，通過有效抑制RAS系統(tǒng)中Ang II的生成，起到抗缺血抗氧化應(yīng)激從而對腎臟具有保護(hù)作用[11]。因此有針對性地改善細(xì)胞能量代謝、抑制氧自由基產(chǎn)生、減少氧化應(yīng)激反應(yīng)可以改善腎臟缺血時細(xì)胞凋亡。曲美他嗪是一種新型獨特的細(xì)胞保護(hù)劑，屬于哌嗪類衍生物。曲美他嗪對缺血細(xì)胞的作用可能是直接的細(xì)胞保護(hù)作用，通過改善缺血細(xì)胞內(nèi)的能量代謝，減少細(xì)胞內(nèi)H+、Na+和Ca2+的超負(fù)荷，抑制氧自由基的生成，提高氧自由基的清除功能[12]。曲美他嗪可能具有抗細(xì)胞凋亡的作用[13]。1989年Aubert證實了曲美他嗪具有抗氧化特性。在缺氧狀況下，線粒體內(nèi)Ca2+超負(fù)荷可引起線粒體腫脹，氧化磷酸化障礙，曲美他嗪可與膜上的可通透性蛋白結(jié)合并使之失活以抑制Ca2+引起的線粒體腫脹，從而減少Cyt-C 釋放，抑制caspase-3 活化，阻止細(xì)胞凋亡[4]。曲美他嗪曾多次被研究證明具有強大的抗氧化作用，可以抑制氧自由基的過度釋放，減少細(xì)胞膜的脂質(zhì)氧化[14]。

在本動物實驗中顯示，與假手術(shù)組相比，模型組的AI值明顯升高，說明CHF大鼠的腎小管細(xì)胞存在明顯的凋亡。藥物干預(yù)后用藥組AI值均有所下降，且聯(lián)合用藥組AI值下降最明顯，說明雷米普利與曲美他嗪均可以抑制腎臟細(xì)胞凋亡，兩者聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。RT-PCR與Western Blot 對Cyt-C檢測的實驗結(jié)果與AI的趨勢保持一致，進(jìn)一步說明CHF大鼠腎功能損害與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

本實驗結(jié)果說明了細(xì)胞凋亡是CHF大鼠腎功能不全的病理基礎(chǔ)；雷米普利與曲美他嗪對腎功能的保護(hù)機制是減少氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，改善腎臟功能，延緩腎功能衰竭，且聯(lián)合用藥療效優(yōu)于單一用藥，且很可能與Cyt-C過表達(dá)和大量釋放有關(guān)。為臨床治療CHF引起的腎功能損害提供了實驗依據(jù)。聯(lián)合用藥對腎臟細(xì)胞凋亡的抑制作用最佳，其詳細(xì)的作用機制，仍需進(jìn)一步研究。

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（編輯：汪碧蓉）

Effect of Ramipril and Trimetazidine on Renal Cell Apoptosis and Cytochrome C Expression in Experimental Rats With Chronic Heart Failure

ZHANG Meng-yun,YANG Xiao-ou, PENG Yu-juan, FENG Xiang-yu, LI Xiu-hua.
Department of Geriatrics, Affliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde (067000), Hebei, China
Corresponding Author: LI Xiu-hua, Email: lixiuhua76@126.com

Ramipril; Trimetazidine; Heart Failure; Apoptosis

河北省衛(wèi)生計生委資助項目(20110180)

067000 河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 老年病科(張夢云、楊曉歐、李秀華)；山東省泰安市，第一人民醫(yī)院 心內(nèi)科(彭玉娟)；河北省，滄州市人民醫(yī)院 心內(nèi)科(馮翔宇)

張夢云 碩士研究生 主要從事慢性心力衰竭的病理生理研究 Email:15632495589@163.com 通訊作者：李秀華 Email:lixiuhua76@126.com

R541.6

A

1000-3614（2015）12-1208-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.018

（2015-03-25）