王曉娜 王曉梅 楊素珍

(山東福瑞達(dá)生物工程有限公司 山東濟(jì)南 250101)

1 背景介紹

歐洲替代方法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM)的創(chuàng)立是以保護(hù)動(dòng)物在試驗(yàn)和其他科學(xué)研究方面的使用為目的,發(fā)展審批有助于縮減、優(yōu)化、替代(Reduce, Refine, Replace, 3Rs)動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法[1-2]。

人類提出組織工程概念,以正常人體皮膚生理結(jié)構(gòu)和功能為理論基礎(chǔ),基于組織工程原理和技術(shù)構(gòu)建的皮膚替代物稱為組織工程皮膚,其具有和皮膚相同結(jié)構(gòu),有表皮,真皮和全層組織[3]。

根據(jù)ECVAM科學(xué)咨詢委員會(huì)(ECVAM Scientific Advisory Committee,ESAC)發(fā)布公告,EpiSkin(L’Oreal)、EpiDerm(ZEBET)和SkinEthic這3種組織工程皮膚先后在1998年3月、2000年3月和2006年11月通過了驗(yàn)證工作。這3種皮膚模型能夠根據(jù)OECD TG 431操作指南來區(qū)分腐蝕性和非腐蝕性化合物,可以將其作為皮膚腐蝕性化合物檢測的動(dòng)物替代方法[4-6]。ECVAM在2003年資助并啟動(dòng)了旨在替代傳統(tǒng)Draize皮膚刺激性檢測(EU Annex V B.4;OECD TG 404)的正式皮膚刺激性驗(yàn)證研究。正式皮膚刺激性研究分兩期完成,第一期分別使用EpiDerm,Episkin和SIFT(Skin Integrity Function Teat,Syngenta),以MTT法檢測細(xì)胞存活率。經(jīng)試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)EpiDerm,Episkin能夠滿足檢測要求[7]。在2007年4月公布了EpiSkin作為Draize皮膚刺激檢測的替代方法。2014年9月歐萊雅在中國獲得人體皮膚重建模型EpiSkin的營業(yè)執(zhí)照,開啟了組織工程在中國的研究與應(yīng)用。

2 EpiSkin皮膚模型簡介

EpiSkin皮膚模型模擬人天然皮膚結(jié)構(gòu),將分離的人表皮細(xì)胞接種在特定的生物材料上進(jìn)行培養(yǎng),形成具有三維結(jié)構(gòu)的人表皮樣皮膚模型。

在中國生產(chǎn)的EpiSkin表皮模型是取自于中國成年人志愿者的陰莖包皮角質(zhì)形成細(xì)胞,這些志愿者都經(jīng)過血清檢測確保不攜帶HIV 1型、HIV 2型、乙肝和丙肝病毒。角質(zhì)形成細(xì)胞被培養(yǎng)在含有Ⅰ型和Ⅳ型膠原的擬真皮替代物上[8]。經(jīng)過體外培養(yǎng)和增殖,表皮模型可以獲得高分化的分層的表皮,并且基于氣液雙相的膠原介質(zhì)上。該表皮模型由基底層、基底上層、棘層、顆粒層和具備屏障功能的角質(zhì)層組成。免疫組織化學(xué)檢測顯示表皮成熟特異性標(biāo)記 profilaggrin、CK1/K10、involucrin 和I型表皮轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的表達(dá);超微結(jié)構(gòu)分析顯示存在透明角質(zhì)蛋白顆粒、張力絲、橋粒等結(jié)構(gòu)。

“EpiSkin”模型試劑盒( 中國生產(chǎn))由12個(gè)表皮模型單位(單位表面積0.38cm2) 、維持培養(yǎng)基和測試培養(yǎng)基共同組成的。這種皮膚模型在皮膚刺激性測試的使用中包括兩方面,一方面是將測試樣品局部滴旋到皮膚模型表面,另一方面是對這些測試樣品對細(xì)胞活性的影響進(jìn)行后續(xù)評估。

歐萊雅的首席科學(xué)家Patricia Pineau指出,為了驗(yàn)證這種人造皮膚的有效性,研究人員還需要證實(shí)該方法能夠像動(dòng)物檢測一樣有效。獨(dú)立的檢測證實(shí),在一些情況下,Episkin能夠比動(dòng)物檢測方法更精確地預(yù)測一個(gè)人是否會(huì)對產(chǎn)品起反應(yīng)。

3 國內(nèi)研究使用現(xiàn)狀

Episkin這種皮膚模型在皮膚刺激性測試的使用中包括兩方面,一方面是將測試樣品局部滴旋到皮膚模型表面,另一方面是對這些測試樣品對細(xì)胞活性的影響進(jìn)行后續(xù)評估。北京出入境檢驗(yàn)檢疫局采用“EpiSkin”3D 人工皮膚模型,按照歐盟 OECD 439 推薦使用的 20 種用于皮膚模型刺激性測試的化學(xué)品,同時(shí)遵循OECD 439的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行皮膚模型的化妝品刺激性測試,并根據(jù)其判斷標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測化學(xué)品對于皮膚的刺激性。采用MTT 方法定量細(xì)胞活力,以相對細(xì)胞活力值為標(biāo)準(zhǔn),與 ECVAM 體內(nèi)測試分類結(jié)果相比較,能正確判定所選 10 種刺激性化學(xué)品中的 9 種,靈敏度達(dá)到 90%;能正確判定 10 種非刺激性化合物中的 7 種,該皮膚模型特異性為 70%。和被歐盟認(rèn)可的 EpiSkin 皮膚模型在歐洲的評價(jià)結(jié)果相一致。得出結(jié)論3D人工皮膚模型“EpiSkin”可以評估化學(xué)品的皮膚刺激性[9]。

4 操作方法

4.1 皮膚腐蝕性體外試驗(yàn)

將EpiskinTM模型與受試物接觸4～6h,液體受試物可直接均勻涂在皮膚模型上,固體受試物先將受試物研磨成粉末均勻鋪在皮膚模型上,加入少許NaCl溶液使受試物與皮膚模型接觸良好,然后用PBS漂洗干凈;用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測受試物對細(xì)胞存活率的影響:將皮膚模型放入20～28℃的MTT溶液中作用3h,然后提取藍(lán)紫色沉淀物,在545nm或595nm波長處測量該沉淀物的光密度。

實(shí)驗(yàn)分別采用NaCl和冰醋酸作陰性和陽性對照。陰性對照的光密度值設(shè)定為100%細(xì)胞存活率,根據(jù)以下公式計(jì)算受試物組的細(xì)胞存活率。

如果受試物組細(xì)胞存活率≤35%,則評定該受試物具有腐蝕性。根據(jù)“將細(xì)胞存活率降到35%以下所需的暴露時(shí)間”對受試物進(jìn)行腐蝕性分級。EpiSkinTM法在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間的比對試驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性很好,可以測試各種不同理化特性的物質(zhì)。

4.2 皮膚刺激性體外試驗(yàn)

將受試物(10μL/mg)涂抹在EpiSkinTM皮膚模型上,18h后用MTT法測試細(xì)胞存活率,如果細(xì)胞存活率≤50%,則該受試物具有刺激性。

5 結(jié)語

歐盟自2009年3月起將禁止利用動(dòng)物進(jìn)行化妝品的測試,也不允許其成員國進(jìn)口經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的產(chǎn)品。按照“4R”原則,發(fā)展快速、高效、敏感的毒理學(xué)安全性評價(jià)替代方法成為主要的發(fā)展趨勢和近幾年國際上的研究熱點(diǎn)之一。我國是化妝品生產(chǎn)和使用大國,建立能與國際接軌的化妝品替代實(shí)驗(yàn)方法具有非常的迫切性。EpiSkin皮膚模型的成功建立在很大程度上解決了這個(gè)難題,在化妝品及原料的檢測中發(fā)揮了重要作用,其必在今后化妝品產(chǎn)業(yè)中占有重要位置。

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