闕菡雅，王小龍，李 杰，徐小艷，夏艷秋，周 舫#

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州450001 2)靖邊縣疾病預(yù)防控制中心慢性病科 靖邊718500 3)河南省職業(yè)病防治研究院毒理科 鄭州450052

肺癌是目前中國發(fā)病率最高的腫瘤，位于致死性癌癥的首位［1］。熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)是機(jī)體受到應(yīng)激刺激后產(chǎn)生的一類高度保守的蛋白質(zhì)，其主要功能是參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白的折疊，從而保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷。研究［2］發(fā)現(xiàn)，HSP70 在肺癌組織中的表達(dá)量高于正常組織。c-jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)是促分裂原活化蛋白激酶超家族的成員之一，應(yīng)激刺激能夠促使其激活并參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究［3］證實(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的HSP70 能夠通過影響JNK 的活化水平來抑制細(xì)胞凋亡。目前關(guān)于抑制HSP70是否能促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的研究較少［4］，因此課題組利用小干擾RNA(siRNA)靶向性下調(diào)人肺腺癌細(xì)胞株A549 細(xì)胞中HSP70 的表達(dá)，觀察細(xì)胞凋亡率的變化，檢測HSP70、p-JNK 和活化型Caspase-3 的表達(dá)量，探討HSP70 在A549 細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制以及HSP70 作為肺癌治療的新靶點(diǎn)的可能性，以期為肺癌的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要材料和儀器 A549 細(xì)胞由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。HSP70 siRNA 由上海吉瑪制藥有限公司合成:正義鏈序列為5’-AGGACGAGUUU GAGCACAATT-3’，反義鏈序列為5’-UUGUGCU CAAACUCGUCCUTT-3’;陰性對照siRNA 正義鏈序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-UUGUGCUCAAACUCGUCCUTT-3’。超純RNA 抽取試劑盒、RT-PCR 定量試劑盒及哺乳動物蛋白抽提試劑盒均購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng) 在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、相對濕度95%條件下用含體積分?jǐn)?shù)10%無支原體胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)、傳代A549 細(xì)胞。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組:空白對照組(僅加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染無關(guān)序列)和干擾組(轉(zhuǎn)染HSP70 siRNA)，每組均設(shè)6個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞密度調(diào)整到(4～5)×104mL－1，接種到12 孔板，每孔1 mL 單細(xì)胞懸液，待細(xì)胞增殖至50%～60%融合時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用瞬時轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine 2000，嚴(yán)格按照說明書操作。

1．4 各組A549 細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測 轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞吹打成密度不低于1．0×105mL－1單細(xì)胞懸液，用PBS 清洗2次后棄去上清，取50．0 μL 的Binding Buffer 重懸細(xì)胞后加入5．0 μL的Annexin V-FIFC 和5．0 μL 的碘化丙啶，室溫下避光反應(yīng)15 min 后，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率。

1．5 各組A549 細(xì)胞中HSP70 mRNA 表達(dá)的實(shí)時定量PCR 檢測 轉(zhuǎn)染24 h 后，PBS 緩沖液清洗12孔板2次后，用超純RNA 提取試劑盒提取RNA 并逆轉(zhuǎn)成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR，以β-actin 作為參照。HSP70 上游引物序列5’-CTG GAGTCCTACGCCTTCAACAT-3’，下游引物序列5’-ACACATTGGGGTAGTAGTAGTCGC-3’;β-actin 上游引物序列5’-CCAGGGCGTTATGGTAGGCA-3’，下游引物序列5’-TGGTTGACCCTGCTATACCTT-3’。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。PCR 反應(yīng)體系:cDNA 2．0 μL，2 ×UltraSYBR Mixture 25．0 μL，上下游引物各1．0 μL，RNase-Free水21．0 μL。PCR 反應(yīng):95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，37個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算HSP70 mRNA 的相對水平。

1．6 各組A549 細(xì)胞中HSP70、p-JNK 及Caspase-3 蛋白表達(dá)的Western blot 檢測 轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組細(xì)胞，提取總蛋白，調(diào)整濃度，使每孔上樣量均為30 μg。蛋白樣品和上樣緩沖液按比例混勻，95℃5 min 變性后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳條件為80 V 40 min，120 V 90 min。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用50 g/L 的脫脂奶粉溶液封閉2 h 后用TBST 溶液洗脫3次，10 min/次，然后一抗(按1∶1 000 稀釋)4℃孵育過夜，二抗(按1∶5 000 稀釋)37℃孵育2 h 以上，TBST 洗3次后，在暗室中進(jìn)行ECL 顯影。用圖像分析軟件Quantity One 分析條帶的積分光密度。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0 進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn)比較各組細(xì)胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK 以及Caspase-3 蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的確定 轉(zhuǎn)染12 h 后，在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染FAM 標(biāo)記的NC siRNA 的A549 細(xì)胞是否成功，并使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染率穩(wěn)定在80%以上。

2．2 各組細(xì)胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK及Caspase-3 蛋白表達(dá)的比較 見圖1、2 和表1。

圖1 各組A549 細(xì)胞中p-JNK 蛋白的表達(dá)

圖2 各組A549 細(xì)胞中Caspase-3 蛋白的表達(dá)

表1 各組細(xì)胞凋亡率、HSP70 mRNA 和蛋白、p-JNK 及Caspase-3 蛋白表達(dá)的結(jié)果(n=6)

3 討論

熱休克蛋白又稱熱應(yīng)激蛋白，是生物體在熱誘導(dǎo)條件下合成的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)。研究［5］證實(shí)HSP70 在正常組織或癌旁組織中低表達(dá)或不表達(dá)，而在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)。劉金鋼等［6］發(fā)現(xiàn)HSP70 與PI3K/AKT 信號傳導(dǎo)通路之間可能具有互相促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的作用，肝癌組織中HSP70、PI3K 和Akt 蛋白表達(dá)是影響患者無瘤生存期的重要因素之一，HSP70 蛋白表達(dá)量越高，患者的預(yù)后越差。RNAi 是由雙鏈RNA 介導(dǎo)的由特定酶參與的特異性基因沉默現(xiàn)象，它能夠在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上阻斷基因的表達(dá)，RNAi 介導(dǎo)的基因沉默具有高度特異性、高效率及高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，因此被廣泛地應(yīng)用于探索基因功能及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域［7］。作者針對HSP70 設(shè)計(jì)的siRNA 能特異性地沉默HSP70 靶基因，熒光定量PCR 及Western blot 結(jié)果表明，與其他2組相比，干擾組細(xì)胞中HSP70 mRNA 及蛋白的表達(dá)水平明顯下降。

細(xì)胞的凋亡受抑制是腫瘤細(xì)胞的主要特征之一。HSP70 作為“分子伴侶”能與癌基因、抑癌基因及其產(chǎn)物相互結(jié)合形成HSP70-癌蛋白復(fù)合體，使得與癌癥相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能保持完整，從而在癌細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡的作用［8］。作者采用siRNA 抑制A549 細(xì)胞中HSP70 的表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率相比空白對照組上升，這也從另一方面表明HSP70 在肺腺癌A549 細(xì)胞中發(fā)揮著抗凋亡的作用。

研究［9-10］表明，誘導(dǎo)型HSP70 能夠抑制JNK 的活化。作者采用RNAi 下調(diào)A549 細(xì)胞中HSP70 表達(dá)水平后，活化型JNK 表達(dá)水平下降，其原因可能是抑制了HSP70 的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)HSP90 反饋性增加，從而抑制活化型JNK 的表達(dá)。有研究［11］表明，在胎盤內(nèi)皮細(xì)胞中HSP70 和HSP90 能夠同時調(diào)控JNK 和ERK 的表達(dá)。Caspase-3 是Caspase 家族的重要成員，是Caspase 依賴的細(xì)胞凋亡過程的最終執(zhí)行者［12］。作者的研究結(jié)果顯示，采用siRNA 下調(diào)HSP70 的表達(dá)后，不但細(xì)胞凋亡增加，且伴隨有Caspase-3 水平的降低，提示siRNA 下調(diào)HSP70 可能通過Caspase-3 之外的途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡［13］。目前已有研究［14］表明使用siRNA 抑制HSP70 的表達(dá)后，褪黑素可以反饋性地抑制其所誘導(dǎo)Caspase-3 的激活，甚至引起其表達(dá)水平的下降。

綜上所述，siRNA 抑制HSP70 的表達(dá)可以促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡，且該過程伴隨著JNK 和Caspase-3 表達(dá)水平的降低。細(xì)胞凋亡的過程是多個信號通路共同作用的結(jié)果，HSP70 可能與其他熱休克蛋白家族成員如HSP90 同時參與多個細(xì)胞信號通路的調(diào)控，具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

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