陳慧平，馬 方，鄒 敏，李繼成，張 艷，趙志鴻，王桂芳，張壯麗，張小俊

鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化研究室鄭州450052

擬缺香茶菜別名野紫蘇，為唇形科香茶屬植物，在我國分布范圍相當(dāng)廣泛，可供藥用者達(dá)30 余種，是民間廣泛使用的草藥，大都具有清熱解毒、活血化瘀、抗菌消炎及抗腫瘤等功效［1］。香茶菜屬植物含有多種次生代謝產(chǎn)物，其中對映貝殼杉烷型二萜化合物是其最主要的次生代謝物［2］。據(jù)報(bào)道［3］，該類化合物具有良好的生物活性，如細(xì)胞毒活性、抗氧化作用、免疫調(diào)節(jié)作用及抗菌抗病毒作用。為了更好地開發(fā)利用該植物資源，尋找其活性成分，該研究采用MTT 法觀察擬缺香茶菜乙醚和乙酸乙酯提取物對人肝癌細(xì)胞株HepG2、人食管癌細(xì)胞株EC9706和人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞株TPC-1 增殖的抑制作用，為進(jìn)一步分離其抗腫瘤活性成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 藥材 擬缺香茶菜采自河南龍?jiān)常?jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院李繼成教授鑒定。將采集的擬缺香茶菜地上部分自然陰干，磨碎，裝入塑料袋密封，置于干燥陰涼處備用。

1．1．2 主要試劑 MTT、RPMI 1640 培養(yǎng)基(美國Solarbio 公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，其余試劑均為市售分析純。

1．1．3 主要儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，型號RE-2000)，CO2培養(yǎng)箱(力康發(fā)展有限公司，型號HF160W)，倒置顯微鏡(奧林巴斯，型號BDS200)，EXL800uv 全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司，型號168-1000XC)，生物安全柜(力康發(fā)展有限公司，型號HFsafe-1200TE)，精密可調(diào)微量移液器(德國Eppendorf 公司)。

1．1．4 細(xì)胞 HepG2、EC9706、TPC-1 細(xì)胞均由鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院藥化研究室提供。

1．2 藥材的提取、分離 取擬缺香茶菜原藥材1 kg，粉碎機(jī)粉碎，用無水乙醚5 000 mL 浸泡21 d(乙醚需淹沒藥材)，用濾紙常溫、常壓下過濾，減壓濃縮得浸膏(乙醚提取物)29 g。將乙醚提取后的殘?jiān)谷敫蓛舻奶麓杀P，常溫下乙醚揮發(fā)完全，直到無乙醚味;把殘?jiān)b入一5 L 球形燒瓶中，加入3 500 mL乙酸乙酯，浸泡24 h，加熱回流2 h，然后常溫、常壓下過濾，得到約2 800 mL 浸取液，減壓濃縮得浸膏(乙酸乙酯提取物)22 g。

1．3 MTT 法測定不同溶媒提取物對各腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用

1．3．1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2、EC9706 和TPC-1 細(xì)胞均為貼壁細(xì)胞，使用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基在37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng);每2～3 d 換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)過程中用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活性。

1．3．2 提取物的處理 分別準(zhǔn)確稱取擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物，加入二甲基亞砜充分溶解后配成100 g/L 母液，置于－20℃冰箱避光保存。臨用前用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1．3．3 MTT 檢測方法 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為(7～8)×104mL－1，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37℃孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后小心吸去上清，加入含0．80、4．00、20．00、100．00、500．00 mg/L(HepG2 和TPC-1 細(xì)胞)或3．12、6．25、12．50、25．00、50．00 mg/L(EC9706 細(xì)胞)擬缺香茶菜提取物的培養(yǎng)基100 μL，并設(shè)空白對照孔。連續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150 μL，置搖床上低速避光振蕩6 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀(檢測波長490 nm，參考波長630 nm)測定，并讀取各孔吸光度(A)值，按下面公式計(jì)算腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率:增殖抑制率=(1 －給藥孔A 值/空白對照孔A 值)×100%，同時(shí)計(jì)算2種提取物對3種腫瘤細(xì)胞的半數(shù)有效抑制濃度(IC50)［4］。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21．0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。5組間細(xì)胞增殖抑制率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn);2種提取物IC50的比較采用兩獨(dú)立樣本的t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 擬缺香茶菜提取物對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 結(jié)果見表1、2。

表1 HepG2 和TPC-1 細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=3) %

2．2 擬缺香茶菜提取物體外抗腫瘤作用的比較 2種提取物對3種腫瘤細(xì)胞的IC50見表3。

表2 EC9706 細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=3) %

3 討論

當(dāng)前腫瘤的化學(xué)預(yù)防研究的主要目標(biāo)之一是尋找高效、低毒的藥物。隨著分子腫瘤學(xué)研究的深入，抗腫瘤天然藥物研發(fā)過程中體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)已成為必不可少的一部分［5］。MTT 法具有靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，常用于抗腫瘤藥的體外初篩試驗(yàn)［6］。

作者選用擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物進(jìn)行了體外細(xì)胞增殖檢測，結(jié)果表明乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對HepG2、EC9706 和TPC-1 細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖抑制作用。研究［7］表明，使用MTT 法進(jìn)行抗癌藥物體外篩選時(shí)，植物粗提物IC50＜20 mg/L 時(shí)，則判斷樣品對體外腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)殺傷作用。在該研究中擬缺香茶菜乙醚提取物對EC9706 細(xì)胞的IC50為(2．36 ±0．15)mg/L，乙酸乙酯提取物對該細(xì)胞的IC50為(4．15 ±0．18)mg/L，提示擬缺香茶菜乙醚提取物和乙酸乙酯提取物對EC9706 細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用。

總之，擬缺香茶菜乙醚提取物對HepG2、EC9706 和TPC-1 細(xì)胞均有較好的增殖抑制作用，尤其是對EC9706 細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)，但其具體活性成分、活性成分抗瘤譜及體內(nèi)抗腫瘤活性等方面還有待進(jìn)一步深入研究。

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