楊曉村，王 穎#，燕樹勛，楊國(guó)杰，張彥周，于超男，李 淵，孫麗娜

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州450052 3)河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 鄭州450008 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科 鄭州450052

高血壓性腎臟損害是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)最主要的原因之一［1］，其具體機(jī)制尚未明確。有研究［2］證實(shí)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過(guò)度激活及其偶聯(lián)的絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失衡等在高血壓性腎臟損害的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來(lái)，睪酮及其受體表達(dá)水平的變化在心血管系統(tǒng)中的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注，但其具有保護(hù)或抑制作用尚存在異議［3-4］。作者所在的課題組前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，睪酮能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，對(duì)心血管有保護(hù)作用，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與MAPKs 相偶聯(lián)。睪酮通過(guò)睪酮受體(androgen receptor，AR)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)作用，然而AR 在高血壓性腎臟損害中的作用及機(jī)制尚不清楚。該研究以AR 為靶點(diǎn)，以腎血管性高血壓大鼠為模型，檢測(cè)大鼠腎組織中AR 和絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase-1，MKP-1)蛋白的表達(dá)，探討AR 在高血壓性腎臟損害中的生物學(xué)意義及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器 30只清潔級(jí)健康雄性Wistar 大鼠(編號(hào)0008508)，28日齡，體重(75 ±5)g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兔抗鼠多克隆AR 抗體(sc-815)、兔抗鼠多克隆MKP-1 抗體(sc-1102)(Santa Cruz 公司)，抗兔IgG 免疫組化試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，DAB 底物顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司)，其他試劑為市售分析純。電熱恒溫干燥箱(上海瀘南科學(xué)儀器廠202-1 型)，冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡CM1900)，攤片烤片機(jī)(德國(guó)萊卡HI 1220 型)，Image-Pro Plus 6．0 圖像分析系統(tǒng)(Media Cybernetics公司)，大鼠尾套血壓儀(日本Softron 公司，BP89A型)，顯微鏡(日本Olympus 公司，dp71 型)。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 實(shí)驗(yàn)大鼠分為3組:對(duì)照組(10只)、假手術(shù)組(10只)、模型組(10只)。模型組:采用“兩腎一夾”法制造腎血管性高血壓大鼠模型。用100 g/L 的水合氯醛(0．003 mL/g 體重)腹腔注射麻醉。沿腹正中線打開腹腔，鈍性分離左腎動(dòng)脈，用“Ω”形銀夾套住腎動(dòng)脈，制造左側(cè)腎動(dòng)脈狹窄，對(duì)側(cè)腎臟和動(dòng)脈不觸及。青霉素腹腔注射預(yù)防感染，關(guān)腹。在造模前，造模后第1、2、3 及8周末，采用Tail-Cuff 法測(cè)量各組大鼠安靜、清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈收縮壓，每只測(cè)3次，取平均值。以造模后血壓高于120 mmHg(1 mmHg =0．133 kPa)且比處理前高20 mmHg 以上為高血壓模型形成。假手術(shù)組:只分離左腎動(dòng)脈不放置銀夾，余手術(shù)同前。對(duì)照組:不予手術(shù)。

1．3 大鼠腎臟質(zhì)量/體重檢測(cè) 造模8 周后，經(jīng)腹腔注射100 g/L 的水合氯醛麻醉，稱取體重后開腹取出右腎稱量，并計(jì)算右腎質(zhì)量/體重比值。

1．4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 分別取大鼠左、右腎組織，置于40 g/L 多聚甲醛中固定，HE 染色，光鏡下觀察。

1．5 大鼠腎組織中AR、MKP-1 蛋白表達(dá)的檢測(cè)取各組大鼠右腎組織，蠟塊包埋、切片、脫蠟、水化，過(guò)氧化氫孵育，抗原熱修復(fù)，血清封閉，滴加兔抗鼠多克隆AR 抗體(按1∶50 稀釋)或MKP-1 抗體(按1∶100 稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，37℃復(fù)溫30 min 后PBS 沖洗，滴加二抗(抗兔IgG)后沖洗、DAB 染色、常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6．0 圖像分析系統(tǒng)測(cè)定兩種蛋白的光密度值。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15．0 處理數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠造模前后不同時(shí)期的血壓，采用單因素方差分析比較3組大鼠腎組織AR、MKP-1 蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn);采用Pearson 相關(guān)分析觀察對(duì)照組和模型組大鼠腎組織中AR 及MKP-1 蛋白表達(dá)水平的關(guān)系。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 造模前后各組大鼠不同時(shí)期的血壓比較 造模1、2、3、8 周后，與對(duì)照組相比，假手術(shù)組血壓值無(wú)變化，模型組血壓升高。見表1。

表1 3組大鼠造模前后不同時(shí)期血壓 mmHg

2．2 造模8 周后3組大鼠右腎質(zhì)量/體重比值比較造模8 周后對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組大鼠右腎質(zhì)量/體重比值分 別為(0．64 ± 0．09)%、(0．62 ±0．11)%和(1．23 ± 0．12)% (F = 107．185，P＜0．001);與對(duì)照組相比，模型組大鼠右腎質(zhì)量/體重比值升高(P＜0．05)。

2．3 3組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果見圖1。與對(duì)照組相比，假手術(shù)組在腎臟形態(tài)學(xué)上無(wú)明顯變化。模型組左腎(左腎動(dòng)脈狹窄8 周后)腎小球萎縮、毛細(xì)血管叢塌陷;右腎大部分腎小球水腫、肥大，入球小動(dòng)脈和小葉內(nèi)動(dòng)脈管壁增厚、水腫，部分腎小球毛細(xì)血管叢萎縮、塌陷。

圖1 3組大鼠腎臟形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

2．4 3組大鼠右腎組織中AR 蛋白的表達(dá) 見圖2、表2。由圖2 可見，3組大鼠右腎組織中均存在一定量的AR 蛋白。由表2 可知，模型組大鼠AR 蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低。

2．5 3組大鼠右腎組織中MKP-1 蛋白的表達(dá) 見圖2、表2。由表2 可知，模型組大鼠右腎組織中MKP-1 蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低。

圖2 3組大鼠右腎組織中AR 和MKP-1 蛋白的表達(dá)(SP，×400)

2．6 3組大鼠右腎組織中AR 及MKP-1 蛋白表達(dá)水平的關(guān)系 對(duì)照組中，MKP-1 蛋白與AR 蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，r =0．457，P =0．184;模型組中，r =0．744，P=0．014。

表2 3組大鼠右腎組織中AR 及MKP-1 蛋白的表達(dá)水平

3 討論

AR 是一種核蛋白，主要分布于內(nèi)分泌生殖系統(tǒng)［6］。已證實(shí)［6-7］血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞及腎臟、血、神經(jīng)系統(tǒng)中均有AR 存在，其既可以通過(guò)與睪酮結(jié)合，通過(guò)反應(yīng)元件來(lái)抑制或者激活靶基因的表達(dá)，又可以通過(guò)EGFR、IGFR、G 蛋白偶聯(lián)受體途徑發(fā)揮不依賴激素的作用，還可以通過(guò)與c-Fos、c-Jun B、Sp1 等相互作用發(fā)揮不依賴ERE 元件的調(diào)控功能。有研究［8-10］表明，AR 表達(dá)水平的變化與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺增生、炎癥反應(yīng)等，但關(guān)于其在高血壓性腎臟損害中發(fā)揮保護(hù)或抑制作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。Pausova 等［11］研究表明，在青少年男性中，AR 蛋白表達(dá)水平的下調(diào)與內(nèi)臟脂肪的代謝以及血壓升高相關(guān)。楚新梅等［12］的研究表明，老年男性高血壓患者中睪酮水平明顯降低，且睪酮水平與AR 呈負(fù)相關(guān)，AR 與舒張壓呈正相關(guān)。該研究以腎血管性高血壓大鼠為模型，采用免疫組化法檢測(cè)腎組織中AR 表達(dá)水平的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組中AR 蛋白的表達(dá)下調(diào)，提示AR 參與了高血壓腎臟損害的過(guò)程。

MAPKs 是多種細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的匯聚點(diǎn)，與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化關(guān)系密切。研究［2，13］證實(shí)，高血壓的發(fā)生發(fā)展與腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過(guò)度激活及其偶聯(lián)的MAPKs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的失衡等關(guān)系密切。MKP-1 是MAPKs 的特異性調(diào)節(jié)磷酸酶，與MAPKs 失活關(guān)系密切。以往的研究［14］證實(shí)，在高血壓心肌重構(gòu)過(guò)程中，不僅僅是單純MAPKs 的過(guò)度激活，同時(shí)還合并有MAPKs 的滅活障礙，表現(xiàn)為MKP-1 蛋白低表達(dá)狀態(tài)。已有研究［2］證實(shí)，在高血壓性腎臟損害中存在MAPKs 的過(guò)度激活，但是否同樣存在MAPKs 的滅活失衡，未見相關(guān)報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)，正常腎臟中存在有一定量的MKP-1 蛋白的表達(dá);且與對(duì)照組相比，模型組MKP-1 蛋白表達(dá)下調(diào)。提示在高血壓腎臟損害過(guò)程中也存在有MKP-1可誘導(dǎo)性減低的狀態(tài)，造成MAPKs 失活障礙。進(jìn)一步的相關(guān)分析結(jié)果顯示，在模型組中，AR 蛋白與MKP-1 蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此推測(cè)，在高血壓性腎臟損害過(guò)程中，AR 與MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)偶聯(lián)、相互作用，共同作用于該過(guò)程的發(fā)生發(fā)展。其具體機(jī)制可能是，在體外AR 可被MAPKs、AKT 及PKC等磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)作用［15］。

綜上所述，在高血壓性腎臟損害過(guò)程中存在AR 及MKP-1 蛋白表達(dá)水平的下降，且二者呈正相關(guān)。提示AR 蛋白表達(dá)下調(diào)參與了高血壓性腎臟損害過(guò)程，并與MAPKs 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路偶聯(lián);這可能為臨床高血壓性腎臟損害防治提供新線索或者新的藥物靶點(diǎn)。

［1］黃裕立，任昊，許頂立．高血壓前期是發(fā)生終末期腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［J］．中華內(nèi)科雜志，2014，53(3):222

［2］姚麗，西山成，安部陽(yáng)一，等．MAPKs 激活在慢性醛固酮灌注所致高血壓腎損傷中的作用［J］．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2004，14(21):15

［3］Corona G，Maggi M．Testosterone supplementation and cardiovascular risk［J］．Trends Cardiovasc Med，2015，25(3):258

［4］Morgentaler A．Testosterone deficiency and cardiovascular mortality［J］．Asian J Androl，2015，17(1):26

［5］孫麗娜，王穎，燕樹勛，等．睪酮對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的乳鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的影響［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2014，49(4):461

［6］劉長(zhǎng)青，吳賽珠，王子?xùn)|，等．睪酮對(duì)人單核細(xì)胞雄激素受體蛋白表達(dá)的影響［J］．第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24(4):389

［7］Sajjad Y，Quenby S，Nickson P，et al．Androgen receptors are expressed in a variety of human fetal extragenital tissues:an immunohistochemical study［J］．Asian J Androl，2007，9(6):751

［8］Huang CK，Pang H，Wang L，et al．New therapy via targeting androgen receptor in monocytes/macrophages to battle atherosclerosis［J］．Hypertension，2014，63(6):1345

［9］郝衛(wèi)軍，曹劍，王浩，等．性激素和雄激素受體與老年男性糖尿病的相關(guān)性研究［J］．中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2009，2(12):986

［10］Li S，Li X，Li Y．Regulation of atherosclerotic plaque growth and stability by testosterone and its receptor via influence of inflammatory reaction［J］．Vascul Pharmacol，2008，49(1):14

［11］Pausova Z，Abrahamowicz M，Mahboubi A，et al．Functional variation in the androgen-receptor gene is associated with visceral adiposity and blood pressure in male adolescents［J］．Hypertension，2010，55(3):706

［12］楚新梅，李小鷹，梁春紅，等．雄激素及其受體和雌激素變化在老年男性高血壓患者中的初步研究［J］．中華老年心腦血管病雜志，2007，9(2):98

［13］呂穎，孫超峰，張軍波，等．自發(fā)性高血壓大鼠大、中動(dòng)脈壁AT1 和AT2 受體表達(dá)的增齡性變化［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，33(5):598

［14］Wang JM，Wang Y，Zhu ZS，et al．Diverse effects of longterm treatment with imidapril and irbesartan on cell growth signal，apoptosis and collagen type Ⅰexpression in the left ventricle of spontaneously hypertensive rats［J］．Life Sci，2004，75(4):407

［15］Edwards J，Bartlett JM．The androgen receptor and signaltransduction pathways in hormone-refractory prostate cancer．Part 1:modifications to the androgen receptor［J］．BJU Int，2005，95(9):1320