尹文龍 郝英魁 全紅娜 潘雁濤 蔣慶峰
[摘 要] 目的:建立YNC 3個(gè)異構(gòu)體的HPLC拆分法。方法:采用CHIRALPAK AD-H柱(4.6×250 mm,5 μm),以正己烷-異丙醇(82:18)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm。結(jié)果與結(jié)論:在選定色譜條件下YNC與其3個(gè)異構(gòu)體完全分離,可用于本品的質(zhì)量控制。
[關(guān)鍵詞] YNC;異構(gòu)體;高效液相色譜;手性固定相
中圖分類(lèi)號(hào):R917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):2095-5200(2015)02-061-03
YNC是一種新型選擇性膽固醇吸收抑制劑,有調(diào)節(jié)血脂功效,目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)廠(chǎng)家生產(chǎn)。YNC結(jié)構(gòu)中有3個(gè)手性中心,理論存在多個(gè)光學(xué)異構(gòu)體,然而臨床以單一構(gòu)型給藥。為了確保用藥安全,控制YNC異構(gòu)體雜質(zhì)限度具有重要意義。
本文建立了對(duì)YNC其中3個(gè)異構(gòu)體HPLC拆分法,此方法靈敏度高,重復(fù)性好,為YNC進(jìn)一步質(zhì)量研究提供可靠分析方法及理論依據(jù)。
1 儀器與試藥
1.1 儀器
Waters E2695高效液相色譜儀(2489型檢測(cè)器,美國(guó)Waters公司);Empower3色譜軟件(美國(guó)Waters公司)。
1.2 試劑
正己烷、異丙醇、乙醇(色譜級(jí),F(xiàn)isher Scientific);Milli-Q超純水;YNC供試品(天津藥物研究院,批號(hào):1401,1402,1403);YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體對(duì)照品(天津藥物研究院)。
2 方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
色譜柱:CHIRALPAK AD-H (4.6×250 mm,
5 μm);流動(dòng)相:正己烷-異丙醇(80:20);檢測(cè)波長(zhǎng)232 nm;流速:1 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量
20 μL。
2.2 溶液配制
精密稱(chēng)取YNC 20 mg于10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,各取1 mL至100 mL容量瓶中,用正己烷-異丙醇(80:20)稀釋至刻度,濃度為 20.00μg/mL,作為YNC儲(chǔ)備液,同法分別配置YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體儲(chǔ)備液,各異構(gòu)體儲(chǔ)備液最終濃度依次為YNC1 20.3 μg/mL、YNC2為21.0 μg/mL、YNC3為 22.0 μg/mL。
2.3 專(zhuān)屬性
2.3.1 精密稱(chēng)YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。同法進(jìn)樣YNC1、YNC2、YNC3異構(gòu)體儲(chǔ)備液,各樣品保留時(shí)間為YNC:20.001min;YNC1:14.332min;YNC2:21.830min;YNC3:25.695min。
2.3.2 加熱破壞 精密稱(chēng)取YNC供試品100 mg至50 mL燒瓶中,加10 mL異丙醇溶解,正己烷-異丙醇(80:20)定容至刻度,于80 ℃水浴回流加熱0.5 h,放至室溫。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,同法以異丙醇作為加熱試驗(yàn)空白對(duì)照。
2.3.3 光照破壞 精密稱(chēng)取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,于光照室(光照強(qiáng)度4500xl)放置一天,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,同法以正己烷-異丙醇(80:20)作為光照試驗(yàn)空白對(duì)照。
結(jié)果表明,在上述條件下均有不同程度降解,并且各破壞條件下降解產(chǎn)物均與主峰達(dá)到良好分離,說(shuō)明本法專(zhuān)屬性較強(qiáng)。
2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)
分別稱(chēng)取YNC、YNC1、YNC2、YNC3適量,用正己烷-異丙醇(80:20)溶解并稀釋制成每mL約含YNC為2μg,YNC1、YNC2、YNC3約為0.5μg溶液,即為系統(tǒng)適應(yīng)性溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣5針系統(tǒng)適應(yīng)性溶液,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。
1.YNC1;2.YNC;3.YNC2;4.YNC3
上述色譜條件下分析,理論板數(shù)以YNC和其異構(gòu)體計(jì)均大于3000,YNC峰及其異構(gòu)體與相鄰色譜峰間分離度大于1.5,拖尾因子符合要求,如表1所示。
2.5 檢測(cè)限與定量限
按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別將YNC、YNC1、YNC2、YNC3儲(chǔ)備液適當(dāng)稀釋至信噪比(S/N)10倍作為定量限,測(cè)得YNC定量限濃度為0.320 μg/mL、YNC1為0.324 μg/mL、YNC2為0.210 μg/mL、YNC3為0.308 μg/mL;稀釋至信噪比(S/N)3倍作為檢測(cè)限,測(cè)得YNC為0.0960μg/mL檢測(cè)限濃度為YNC1為 0.0972μg/mL、YNC2為0.0630 μg/mL、YNC3為0.0924 μg/mL。
2.6 線(xiàn)性
精密量取YNC儲(chǔ)備液各0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、2.0 mL至10 mL容量瓶中,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,并取其定量限溶液,即為各濃度線(xiàn)性溶液。同法配置YNC1、YNC2、YNC3各線(xiàn)性溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,每濃度進(jìn)樣3針,記錄色譜圖。
以濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),以3針?lè)迕娣e平均值為縱坐標(biāo),進(jìn)行線(xiàn)性回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。
結(jié)果表明YNC1、YNC2、YNC3對(duì)照品在各自測(cè)定濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。
2.7 重復(fù)性
精密稱(chēng)6份YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。按“2.1.”項(xiàng)下:總雜質(zhì)峰面積和YNC主峰面積計(jì)算得主峰峰面積RSD為1.49% 總雜質(zhì)RSD為1.44%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.8 穩(wěn)定性
精密稱(chēng)取YNC供試品20 mg至10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,室溫放置,在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。按總雜質(zhì)峰面積和YNC主峰面積計(jì)算得主峰峰面積RSD為1.20% 總雜質(zhì)RSD為3.25%,表明本品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。
2.9 回收率
精密稱(chēng)9份批YNC 20 mg至10 mL容量瓶中,每份加2 mL異丙醇溶解,然后每3份為1組,依次加入YNC1、YNC2、YNC3儲(chǔ)備液各0.8 mL、1.0 mL、1. 2 mL至3組容量瓶中,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,即得9份回收液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,記錄色譜圖。
上述色譜條件下分析,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表3。
結(jié)果顯示YNC1、YNC2、YNC3回收率均在90%~110%之間,符合要求。
2.10 耐用性實(shí)驗(yàn)
分別考察了流速變化±0.1 mL/min、柱溫變化±3 ℃、檢測(cè)波長(zhǎng)變化±3 nm、流動(dòng)相比例變化±3%條件下系統(tǒng)適用性和有關(guān)物質(zhì)含量變化,表明系統(tǒng)適用性均符合要求,異構(gòu)體含量無(wú)明顯變化,表明方法耐用性良好。
2.11 校正因子測(cè)定
按線(xiàn)性測(cè)定方法計(jì)算得YNC對(duì)照品線(xiàn)性方程為Y=53515X-4851.9 R=0.9994。則YNC1、YNC2、YNC3校正因子分別為0.93、0.97、1.07。各異構(gòu)體校正因子均在0.9~1.1之間,可按不加校正因子主成分自身對(duì)照法測(cè)定各異構(gòu)體含量。
2.12 樣品異構(gòu)體檢查
精密稱(chēng)取YNC原料藥20 mg于10 mL容量瓶中,加2 mL異丙醇溶解,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,配置成2 mg/mL YNC供試品溶液。精密量取供試品溶液1 mL,置100 mL量瓶中,用正己烷-異丙醇(80:20)定容,作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)樣分析,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分色譜峰峰高為滿(mǎn)量程10%~20%。再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件,取供試品溶液進(jìn)樣分析,結(jié)果只檢出YNC2異構(gòu)體,按不加校正因子主成分自身對(duì)照法計(jì)算,YNC1401、1402、1403批原料藥中異構(gòu)體YNC2含量分別為0.07%、0.06%、0.07%;各批結(jié)果均小于0.1%,即小于對(duì)照溶液峰面積1/10,結(jié)果見(jiàn)表4。
3 討論
3.1 色譜柱選擇
我們初步嘗試CHIRALPAK IA、AS-3、AD-H柱(規(guī)格均為4.6×250 mm,5 μm)對(duì)樣品進(jìn)行分離考察,結(jié)果顯示,各異構(gòu)體在IA柱下保留時(shí)間接近,分離度差;在A(yíng)S-3柱中各異構(gòu)體峰理論塔板數(shù)較低;AD-H柱能對(duì)其3個(gè)異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)分離,且分離效果良好,因此選擇AD-H。
3.2 流動(dòng)相優(yōu)化
考察了正己烷-乙醇、正己烷-異丙醇2個(gè)流動(dòng)相體系,異構(gòu)體定位試驗(yàn)顯示,2個(gè)體系中各異構(gòu)體出峰時(shí)間和出峰次序區(qū)別很大,由于正己烷-異丙醇體系中各峰理論塔板數(shù)明顯高于正己烷-乙醇體系,見(jiàn)表5。因此選用正己烷-異丙醇作為本試驗(yàn)流動(dòng)相體系。
4 結(jié)論
用HPLC法對(duì)手性藥物拆分主要有手性衍生化法,手性流動(dòng)相添加劑法,手性固定相法,其中手性固定相法應(yīng)用最為普遍。CHIRALPAK AD-H柱固定相為表面涂敷了手性多聚物[直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯氨基甲酸酯)]球形硅膠,對(duì)大多數(shù)異構(gòu)體有極高手性能力。
本文采用CHIRALPAK AD-H柱成功拆分了YNC3個(gè)光學(xué)異構(gòu)體,分離度良好。所建立靈敏度高,分析方法快速,適用于YNC原料藥中異構(gòu)體雜質(zhì)檢查。
參 考 文 獻(xiàn)
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